1生物统计与实验设计3常用分子生物学技术技术总结.pptVIP

四、SSR技术 真核生物基因组中散布着大量的小卫星DNA和微卫星DNA，小卫星DNA由串联重复的短序列组成，它的重复单位一般在十几到几十bp，一个小卫星DNA的总长度达几十到几千个bp不等。微卫星DNA由更短的重复单位串联而成，重复长度一般为2~6bp，一个SSR总长度可达几十到几百bp。许多小卫星和微卫星间的不等交换或复制过程中的DNA滑动而高度可变，因而显示出了丰富的限制性片段多态性。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列两端往往是相对保守的限制酶位点，所以通过特异引物进行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，就可检测到简单重复序列单位数不同的DNA区域多态性。 五、 mRNA差异显示反转录PCR 技术 mRNA差异显示原理：是通过比较两个来源不同的材料的mRNA来确定差别显示的原因，并可进一步分离出差异的基因。其方法是：人工合成两组引物，对细胞中约15000种转录的mRNA进行cDNA扩增，并显示出它们的电泳条带，不同材料的电泳条带比较，就可发现差异的基因。 5′—AGAAAAA……AA—3′ 5′—GTAAAAA……AA—3′ 5′—CGAAAAA……AA—3′ 5′—TTAAAAA……AA—3′ 5′—GGAAAAA……AA—3′ 5′—ACAAAAA……AA—3′ 5′—TGAAAAA……AA—3′ 5′—CCAAAAA……AA—3′ 5′—ATAAAAA……AA—3′ 5′—GCAAAAA……AA—3′ 5′—CTAAAAA……AA—3′ 5′—TCAAAAA……AA—3′ 在第一条cDNA合成时所加入的含有Oligo(dT)n的寡核苷酸引物，是根据mRNA分子3′端序列结构而设计的。mRNA分子3′端的poly(A)序列起点碱基之前的2个碱基，除了AA组合外，只可能有如下12种可能的排列组合： 根据这种序列结构特征，Pliang等人设计合成了共12种不同的下游引物，称之为3′端锚定引物（anchor primer, Anp.），它由11或12个脱氧胸苷酸（T）加上两个3′端锚定脱氧核苷酸组成。可用通式5′—T11MN或5′T12MN来表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、T、C、G）。 因为某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA总的含量相当低。因此我们还必须通过PCR，才能使cDNA在量上得以扩增。因此，需要再加入一种随机引物，使之与mRNA（cDNA）5′端结合，对两个引物间的cDNA序列扩增。如果5′ 端引物在mRNA（cDNA）上的识别位点距poly（A）尾在2～3kb范围内，则任一cDNA可通过PCR而扩增， 5`-gatcggacccttmnAAAAAAAA 5`mnTTTTTTTTTT 5`-ctagcctgggaamnAAAAAAAA3` cDNA 5` __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ 二、PCR反应中的几种成分 1、Taq DNA聚合酶 1976年，Chien.A从一种生活在温度高达75℃的热泉的细菌（即栖热水生菌，Thermus Aquaticus）中分离纯化出了一种耐高温的DNA聚合酶，现命名为TaqDNA聚合酶。这种酶经95℃持续温育仍有活性，因此在DNA变性加热的温度下不会失活，故无需在每轮反应中补加新酶。 TaqDNA聚合酶与Klenow大片段相比，缺少3′→5′的外切核酸功能，但具有5′→3′的外切核酸酶功能，故Taq酶缺少校对活性。 2、关于PCR引物 Rappolee指出引物设计需要根据以下原则： （1）引物应是DNA序列的一段高保守区； （2）引物3′端的保守序列很重要，并要求非简并性密码，密码的第三个碱基不应摇摆； （3）引物3′端不能互补，不能具有反转重复序列，避免形成引物二聚体； （4）引物的设计应避免形成二级结构； （5）避免引物中G/C和A/T富聚区的不平衡分布，但允许有OligodT和polydC； （6）引物是特异性的，不能与其它基因的序列同源； （7）根据实验设计要求可以在引物5′端进行特殊设计，即加入几个碱基以便在扩增产物中创造一个限制性酶切位点，或一个GC box，或一个启动子。较长的引物-模板杂合体的Tm值较高，因此在PCR的最初几次循环之后需要适当增加融合温度； （8）为了进行未知序列的扩增，需要对引物进行特殊设计。 3、用于PCR扩增的模板 4、用于PCR扩增的dNTP 单链、双链DNA以及通过逆转录的cDNA都可