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第二节 蛋白质的共价结构 蛋白质(protein)是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。 蛋白质的化学组成 蛋白质分子中主要的元素组成是：C、H、O、N、S等。其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于6.25克蛋白质。 蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数 ? 6.25 （凯氏定氮法） 肽(peptide) 肽键与肽链： 蛋白质是由若干氨基酸的氨基与羧基经脱水缩合而连接起来形成的长链化合物。一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基在适当的条件下经脱水缩合即生成肽。 两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。 多肽链具有方向性，头端为氨基端（N端），尾端为羧基端（C端）。 凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构?者称多肽。 生物活性肽： 生物体内具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。 1. 谷胱甘肽（GSH）： 全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。 谷胱甘肽的生理功用： 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。 2. 多肽类激素： 种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。 蛋白质一级结构的测定 胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。 测定蛋白质的一级结构的主要意义： 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。主要意义： 一级结构是研究高级结构的基础。 可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。 可以为生物进化理论提供依据 可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。 蛋白质的氨基酸组成分析 测定步骤 蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤： 1.测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 2.多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). DNFB法分析N-端氨基酸残基 肼解法分析C-端氨基酸残基 胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用 BrCN的裂解作用它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 7.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。  Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 Edman降解法测定氨基酸序列 氨基酸自动测序仪 8.确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 羧肽酶法 6.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 ? 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 ? 化学法：可获得较大的肽段 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 多肽链断裂法：酶解法和化学法 Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。 肽链 水解位点 胰蛋白酶 或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。 肽链 水解位点 糜蛋白酶 Pepsin：R1和R2＝R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 肽链 水解位点 胃蛋