ALA-PDT对Hela和Caski细胞增殖凋亡机制的初步探讨.pdfVIP

中文 摘 要 宫颈 癌 是妇 科 常 见 的恶 性肿 瘤 之 一 ，全 世 界每 年 有 25 万 妇 女死 于 宫颈癌 ， 约 50 万 宫颈癌 新 发病例 ， 目前 已明确 HPV 感染特 别是 高危型 HPV 持续感染 与 宫 颈癌 发病 的密切 关 系 。在所有 HPV 感染妇 女人群 中，最 终约有 10%发展 为 HPV 持 续感 染状 态 。临床 上仍缺 乏有效 的清 除 HPV 感染 的手段 ，目前 没有针对 HPV 的治 疗 药物 ，临床 上 常用 的干扰 素 、HPV 预 防性疫 苗疗 效亦 有 限，针 对大量 HPV 持 续 感 染 状 态 人 群 ， 亟 待 有 效 的 防 范 或 干 预 措 施 。光 动 力 疗 法 （photodynam ic therapy, PDT ) 具有创伤 小 、选择性强 、重复性好 、毒性小等优 点， 目前 已广 泛 应用 于 多种 恶性肿 瘤 的治疗 ，但 在妇产科疾 病特 别是 宫颈疾病 方 面仍处 于起 步 阶 段 。本 实验 选 用 的光 敏 剂 5-氨 基酮 戊 酸 （5-am ino levu lin ic，ALA ) 是第 二代 光 敏 剂 ，能选 择 性 地 积 聚在 病 毒感 染增 殖 活 跃 的细 胞 中 ，克服 第 一 代 光敏 剂在 体 内 滞 留时 间长 、所 需避 光 时 间长 、组织选择 性 差等缺 陷 。本 实验 以宫颈 鳞 癌 细 胞 Ca sk i 细 胞 和 宫颈 腺 癌 细 胞 He la 细 胞 为研 究对 象 ，通 过 SRB 法 、流式细 胞仪 、 荧光 实 时定量 PCR 、蛋 白免疫 印迹法 ，探 讨 新 型光敏 剂 5-氨 基 酮 戊 酸介 导 的光 动 力 治疗 (ALA-TO T)清 除 HPV 感 染 的机 制和 诱 导其凋 亡 的分 子机 理 ，为 ALA-PDT 最 终走 向临床 提供 实验 依据 和 理论支 持 。 目的 1.观 察 ALA-PDT 对 宫颈癌 细 胞 He la 、Ca sk i 细胞 生长 的影 响 ，并筛选 出 ALA-PDT 对 宫颈癌 细 胞 生长 影 响 的最佳 作 用参 数 （光 敏 剂浓 度 +激 光剂 量 ）。 2.观 察 ALA-PDT 对 宫颈 癌 细胞 He la 、Ca sk i 细 胞 HPV 18/ 16 E6 、E7 基 因 mRNA 的 影 响 ， 明确 其 清 除 HPV 感 染 的能力 。 3.测 定 ALA-PDT 对 宫颈 癌 细胞 Hela 、Ca sk i 细胞 调 亡相 关 基 因表 达 的影 M卩，探 寻 ALA-PDT 诱 导 凋 亡 的通 路 。 方 法 1. SRB 法 检测 ALA-PDT 作 用 于 宫颈癌 细 胞 H e la 、Ca sk i 细 胞后 细 胞 生长 的变化 ， 并 比较 两种 细胞对 ALA-PDT 的敏感性 差异 。 2. Annex in V/P I 染 色-流 式 细胞 仪检测 ALA-PDT 对 宫颈 癌 细胞 H e la 、Cask i 细 胞 凋 亡 的影 响 。 3. Rea l- time PCR 检 测 ALA-PDT 对 宫颈癌 细胞 Hela , Cask i 细 胞 内 Caspa se-3 、 P53 、HPV 18/ 16 E6/E7 m RNA 表 达 水 平 的影 响 。 4. W estern B lot 检 测 A LA-PDT 对 宫颈 癌 细 胞 He la 、Ca sk i 细 胞 内 P53 、c leaved Caspase-3 蛋 白的表达影 响 。 结 果 1. SRB 检 测 A LA-PDT 对 H e la 和 Cak si 细 胞 增 殖 作用 的影 响 ：单 纯 的光 敏 剂 ALA 组 或 者 单 纯 的光 动 力 PDT 组 作 用 于 细 胞 ，与对 照 组相 比 ，细 胞 的生存 率 差 异 无 统 计 学 意义 （P 〉0.05 ) 。同一激 光 剂 量 、不 同光敏 剂浓 度 下 ，细 胞 的生存 率 有 显 著 差 异 （P 0. 05 ) 。对 H e la 细 胞 当光 敏 剂浓 度 在 0. 05-0. 15mM 之 间 ，对 Cask i 细 胞 当光 敏 剂 浓 度 在 0. 05- 0. 20mM 之 间时 ，细 胞 的生 长 抑 制 率 随着 ALA 浓 度 增 加 而 显著提 高 （PC 0.05 )。同一 光 敏 剂