3_高压液相色谱(HPLC)方法建立总绪论试卷.pptVIP

高压液相色谱（HPLC）方法建立总绪论 Chung Chow Chan, Ph.D. YC Lee, Ph.D. HPLC方法建立导言 约定: 药物小分子 从基础开始的方法建立 药品杂质HPLC 术语 药物质：活性成分 相关物质：降解物、合成杂质、生产杂质 可信的样品：相关物质的纯化样品 控制样品：选择用来在方法实施中确保所有分析一致性的测试品。 ICH 杂质指南 报告极限 鉴定极限 合格极限 我们要学习什么? HPLC方法建立中的主要单元 方法建立计划 1. Critical components in HPLC method 1.1 样品制备 1.2 HPLC 条件 1.3 计算/标准化 1.4 系统可适性 2. 方法建立计划 2.1 确定方法目的 2.2 初始HPLC条件 2.3 样品制备 2.4 标准化 2.5 最后方法优化 2.6 方法验证 1.1 样品制备 样品溶液 (pH 与有机物含量百分比) – 萃取效率（精度、准确度） 样品大小、样品浓度-方法灵敏度（LOQ） 液态或固态组成 – 准确度 复测 –精度 制备过程 – 程式化 1.2 HPLC 条件 流动相组成-特性 柱子温度 – 稳定性 检测波长 – 准确度, LOQ 注射体积 – 精度, LOQ 柱子类型 – 专属性 1.3 计算 标准化 – 准确度 外标 面积百分比 高-低 响应因子 – 准确度 标准浓度 – 准确度 1.4 系统可适性 5-6次注射的精度 分辨率 – 临界分辨率 痕量 – 痕量因子影响分辨率 灵敏度 – 低浓度条件下的信噪比（S/N ） 特殊极限 LOQ LOD ICH 报告极限 系统可适性 如果没有供常规分析的可信样品，如何检查临界配对的分辨率？ 系统可适性- 分辨率 临界配对 分辨率图标 现场生成 典型的系统可适性 色谱: 临界配对的分辨率 药物活性成分的痕量因子 基线 (无干扰系统峰) 监测器灵敏度 (信/噪比) 药物活性成分峰比例 (用于面积百分比方法) 标准制备的精度（用于外标方法） 使用控制样品 控制样品 2. 方法建立计划 2.1 定义方法目的和了解化学 (10%) 确定方法建立的目的（例如方法用于什么？）和了解被分析物质和药品的化学。 2.1.1 方法目的 被分析物质: 重要组成Significant (需要 LOQ,线性、准确性） 相对于其它相关物质、强度测试、低于 LOQ 稳定性指示 分辨率 – 临界配对、分辨率的稳定性 LOQ – 方法灵敏度、IPC报告极限 2.1.1 方法目的（续） 精度、准确度 分析时间预期 程式化-见下一章节 易于自动化 2.1.1.1 方法的程式化 样品制备: 称重 (大于 10 mg) 稀释体积dilution volume (大于 5 mL) 无超声震动、使用摇晃 样品溶剂=流动相 使用面积百分比方法 2.1.1.1 方法程式化（续） HPLC 条件: 最佳吸收UV 的波长 预混流动相 缓冲容积 柱子加热装置 等度 (或使用简单梯度) 2.1.2 了解你的被分析物 电离常数 化合物 A: pKa = 2.5 化合物 B: pKa = 3.5 哪一个是更强的酸？ 了解你的被分析物 有机酸 A: pKa = 2.5 有机酸 B: pKa = 6.5 在 pH = 4.5 的缓冲溶液, 哪一个是中性组份？ 对于上述两个化合物，获得较好的HPLC分辩率的最佳pH是什么？ 碱性化合物滞留时间是pH 和pKa的函数 缓冲溶液的pKa 缓冲溶液 pKa 磷酸盐（phosphate） 2.1, 7.2, 12.3 醋酸盐（acetate） 4.8 柠檬酸盐（citrate） 3.1, 4.7, 5.4 硼酸盐（borate） 9.2 二乙胺（diethylamine） 10.5 什么是磷酸盐缓冲溶液合适的pH 范围？ 了解你的被分析物-溶解度 溶剂 溶解度 (mg/mL) 0.1N HCl 13 pH 2.5 磷酸盐缓冲溶液 10 流动相 (pH 4.5) 1 pH 7 磷酸盐缓冲溶液 0.03 甲醇 50 乙腈 150 哪一个是HPLC方法的最佳溶剂? 使用什么来建立方法？ 重要的降解产物 其它降解产物 药品生产过程中的杂质 来自活性成分的合成杂质 2. 方法建立计划 2.2 初始HPLC条件 (20%) 建立一套初步的HPLC条件达到最低可以接受的分离度。这些HPLC条件将用于接下来的所有的方法建立程序。 初步HPLC条件目的 为方法建立设置HPLC初步条件 不是最后的方法条件 仅仅针对“重要的”相关物质 2.2.1 在初步方法建立中使用什么样品? -使用大约5%降解度的降解样品 -含有1-2