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使用 Agilent 6530 Q-TOF 对单克隆抗体药 物的二硫键连接进行确认 应用简报 制药行业 作者 摘要 左帅 本文介绍了使用 Agilent 6530 Q-TOF 采集肽段数据，采用整合有 安捷伦科技（中国）有限公司 BioConfirm 的 MassHunter 定性软件，通过软件中的蛋白酶解产物比较功 能 (Compare Protein Digest Files) ，实现了对单克隆抗体药物中二硫键连接 的确证。此方法无需对样品进行额外的标记，仅通过对还原和非还原组样品 的一级质谱进行比对，即可实现对样品二硫键连接的确认。 1 前言 样品制备 二硫键（S-S 键）是通过蛋白质中两个半胱氨酸上的巯 取 40 µg 单克隆抗体药物溶解于 25 µL 的 6 mol/L 盐酸 基 (-SH) 氧化而形成的，在稳定蛋白质构象和保持其活 胍中，加入 1 µL 100 mmol/L pH 6.6 的 N- 乙基马来酰 性方面起着重要的作用。抗体药物中二硫键的排布是对 亚胺 (NEM) ，使 NEM 的摩尔量为抗体样品中半胱氨酸 其结构特性的一种反映，因此二硫键连接形式的确认成 残基含量的 5 倍，37 ℃孵育 2 小时。将溶液调节至 pH 8 ， 为抗体药物结构确认过程中非常重要的一环。本文介绍 并均匀分成两组，分别为还原组和非还原组。在还原组样 了使用 Agilent 6530 Q-TOF 采集肽段数据，采用整合有 品中加入 3 µL 100 mmol/L 二硫苏糖醇 (DTT) ，使 DTT BioConfirm 的 MassHunter 定性软件，通过软件中的蛋 的最终摩尔量高于样品中半胱氨酸残基含量的 25 倍，37 白酶解产物比较功能 (Compare Protein Digest Files) ， ℃ 孵育 1 小时。在还原组与非还原组样品中均加入 9 µL 实现了对单克隆抗体药物中二硫键连接的确证。本文采用 100 mmol/L 碘乙酰胺 (IAM) ，IAM 的摩尔量为样品中半 一级质谱比对的方法对抗体药物的二硫键连接进行确认。 胱氨酸残基含量的 75 倍以上，室温避光孵育 20 分钟。 在通常的肽段质谱分析中，一级质谱的信号明显强于二级 将两组样品溶液超滤，使其盐酸胍浓度降低至 0.1 mol/L 质谱。且以二硫键连接的肽段通常会含有两条甚至两条以 以下，并将缓冲液体系替换成 50 mmol/L 碳酸氢铵，按 上的肽段，其二级质谱较为复杂。因此，使用一级质谱进 胰酶: 蛋白 1:50 的比例加入胰蛋白酶，37 ℃过夜酶解。 行二硫键连接肽段的分析更容易被软件识别和匹配，避免 实验条件 了对其复杂二级碎片的识别和鉴定。 采用相同的反相液相色谱 - 质谱条件，对胰蛋白酶消化的 实验部分 DTT 还原和非还原的单克隆抗体药物的酶解多肽溶液分 别进行分离和检测。 试剂 盐酸胍（Sigma ，G4505），N- 乙基马来酰亚胺（Fluka ， 04260 ），二硫苏糖醇（Fluka ，43819 ），碘乙酰胺（Sigma ， I114