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毕赤酵母电击转化注意事项
一、 制备感受态的菌液收集时间:
1、准确测定OD值:OD在1.2~1.5之间。
1) 为了准确测定OD值,建议将菌液稀释不同浓度测定(1、2、4、8、16倍稀释,看其OD值是否呈线性关系)。每个倍数做3-5个重复,应该可以大致推断OD值是否准确!菌液看上去浑浊,但OD值不高,很可能OD稀释倍数不够!
2) OD值是否测准也可以这样估算:OD600为40左右时,菌体湿重(6000rpm离心5min)约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌,经18h左右的培养,最后sorbital洗涤完毕后,50ml离心管里所剩菌体特别浓,需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2~1.5之间的500ml菌液,收集的感受态也用1ml稀释的,没那么粘稠。可以看看降低培养温度(27摄氏度)或缩短培养时间(12h)。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50-100mlYPD中摇过夜,效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品,50ml就够了,一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的,其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液,然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态,每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短,制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心,洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度,不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因,在冰上放几个小时再做可能有一定的影响,尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存,不需要加甘油,一般80ul EP管分装,-70 或 -80 摄氏度保存。
另附:酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基,30℃,200rpm振荡过夜,涂布 YPD平板,30℃培养48 小时,用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化,挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板,4℃保存。
四、电转化注意点:
1、感受态做好后,最后一次吸出sorbital)时,不是直接倒调的,而是用毛细管轻吸出来的,这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、最后用毛细管取出100ul出来,加入质粒,混匀!(怕量不够,吸得很多,电转时效果反而不好。 )
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗,洗净;然后浸泡在75%的乙醇中;使用前我们都是放在超净台上,开启紫外,边吹风晾干,边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候,电压数以及电击时间可以摸索一下,适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv,放电4.8~5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行,电击时间可以减少一点,设置为5ms左右,电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液,转移至EP管,30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候,在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后,加入1ml的山梨醇,吸入1.5ml的ep管中,置于30度摇床低速培养1h,再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上,按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适,以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好,放在冰箱里,涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些积层,反而不利于生长。
2、YNB42度水浴一会,然后过滤除菌,YNB是加到培养基里面的,去离子水pH偏低,建议直接用蒸馏水就可以(关系不是太大)。
3、山梨醇,以及无菌去离子水均是冰冻,存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞,转化效率很高,可以试试。建议你不要用胶回收kit),回收的DNA可能还有盐,导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一:高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中,4℃、10000g 离心1min,弃上清,沉淀用无菌水(4℃)洗涤,同样条件下离心,弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液,室温下放置20min。
处理液:
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心,弃上清,加入1ml 1M sorbitol ,离心,
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