糖基化蛋白的分离纯化.PPTVIP

蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用 Detection of Protein Glycosylation Modifications and Its Applications 05级生物技术3班 张思春 蛋白质可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质，单纯蛋白仅由氨基酸组成，不含其他化学成分；许多其他蛋白质含有除氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分，这样的蛋白质称为缀合蛋白质。缀合蛋白质可以按其非氨基酸成分分为糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、磷蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白等。 根据糖肽链的类型，蛋白质糖基化可以分为四类 以丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点，形成-O-糖苷键型； 以天冬酰胺的酰胺基、N-末端氨基酸的α-氨基以及赖氨酸或精氨酸的ω-氨基为连接点，形成-N-糖苷键型； 以天冬氨酸或谷氨酸的游离羧基为连接点，形成酯糖苷键型； 以半胱氨酸为连接点的糖肽键。 主要内容 糖基化蛋白质的研究方案 糖基化蛋白质的鉴定 糖基化蛋白的分离纯化 糖基化蛋白的表征 糖基化蛋白质的功能研究 蛋白质人工糖基化改性的研究 糖基化蛋白质的研究方案 研究过程与内容： 1：鉴定糖蛋白，即确定糖蛋白的存在； 2：富集糖蛋白，即糖蛋白的分离纯化； 3：对糖蛋白进行表征的基础研究:一是糖蛋白中蛋白的表征，即糖基化氨基酸位点的鉴定；二是糖蛋白中糖链的表征，即糖组成的确定和糖含量的测定； 4：对糖蛋白进行功能研究，即弄清楚糖蛋白的作用机制，以及对生物体影响； 5：在上面的基础上进一步开展糖蛋白的应用研究，根据糖蛋白的功能进行人工改性，以满足人类的需要。 糖基化蛋白的鉴定方法 1. 放射性标记法 2. 分子荧光标记法 3. 电泳法 4. 凝集素标记法 5. 抗体标记法 6. 化学酵素法 放射性标记法 放射性标记法将3H或14C标记的糖加入培养的细胞或组织中，通过放射性自显影检测糖蛋白.也可以通过对糖蛋白的受体进行放射性标记，检测蛋白质糖基化水平，如放射受体分析法。在许多细胞（如单核-巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等）表面都存在能与糖蛋白特异性结合的膜蛋白，故可通过放射性标记膜蛋白来检测蛋白水平。此法多用于病毒诱导的肿瘤细胞的研究，检测灵敏度高，但放射性标记的过程缓慢、具危险性，花费大。 分子荧光标记法 分子荧光标记法是检测糖基化蛋白质较经典的方法。由于某些糖基化蛋白质具有自发荧光的特性，因而可用荧光分光光度计测定荧光值来反应蛋白质糖基化水平。目前广为采用的是激发波长370nm/发射波长440nm。该法灵敏度和重复性都较好，但只能检测部分糖基化蛋白质且特性欠佳，易受环境因素影响。 电泳法 电泳法是传统的糖基化蛋白检测方法。单、双向电泳均可检测糖蛋白的存在。糖基化血红蛋白的分离与糖基化水平的测定多采用SDS法和亲和电泳-比色法。采用Acid/SDS和NR/R-SDS两种双向凝胶电泳，Lauriere等对小麦贮藏蛋白的糖基化进行了鉴定。现在大多数双向电泳都采用等电聚焦(IEF)/SDS,几乎成为直接高通量获得全蛋白表达图谱的惟一有效手段。 凝集素标记法 凝集素标记法是最常用的糖蛋白检测法。凝集素可特异性吸附糖蛋白，因而被广泛用于糖蛋白的鉴定。Tilley等运用凝集素对小麦高分子量谷蛋白亚基的糖基化进行了鉴定，在中国春和TAM105品种的高分子量谷蛋白亚基2，7，8，12中均发现有糖基化现象的存在。Kaji等采用凝集素亲和捕获柱，成功鉴定出250个线虫N-糖蛋白。 抗体标记法 抗体标记法是针对糖蛋白所带糖链的类型制备各种抗体，对糖蛋白进行检测。Lauriere等采用免疫印迹的方法对小麦贮藏蛋白的糖基化进行了鉴定，结果显示小麦蛋白N-糖基化为木糖型。Cieniewski-Bernard等利用抗O-GlcNAc抗体检测出小鼠骨骼肌中糖蛋白的存在。 化学酵素法 化学酵素法是一各较新的标记糖基化蛋白质的技术。Khidekel等率先利用此方法构建了一种半乳糖基转移酶，可选择性地给糖基化蛋白标记上含酮基的蛋白毒素抗体，成功地在老鼠的前脑中鉴定出25种与基因表达、神经信号转导、突触可塑性等功能相关的O-糖基化蛋白，并且肯定了此方法可推广至各种组织中的糖蛋白的标记及功能鉴定。 糖基化蛋白的分离纯化 获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和层析法。 电泳法即是通过电泳的方法先得到糖蛋白条带或蛋白点，再通过电洗脱或透析的方法得到糖蛋白。（此方法较为费时，且在操作中易使蛋白变性） 层析法快捷、准确、分辨率高、稳定性好，是分析糖蛋白的理想手段。 目前利用抗体、凝集素进行亲和层析已成为分离纯化糖蛋白的最主要方法。除此之外，已有人开始利用多维高效液相色谱对蛋白质进行液相图谱分析，并全新研制并测试了一种新的蛋白质组二维分离和差异表达鉴定方法，称为2-D Prot