实验四 从猪肝中分离提取DNA和RNA 10-5-15.ppt

二 实验原理： 实验安排： 本次实验每个实验台分为A、B两组 A组----提取 RNA B组----提取 DNA 药品的配制： 1．0.1mol/L NaCl - 0.05mol/L, pH7.0 柠檬酸钠缓冲液 1000ml 柠檬酸钠 29.412g NaCl 11.7g 加蒸馏水至 2000 ml 2. 10 % NaCl 800 ml NaCl 80g + 800 ml 蒸馏水 3. 氯仿—异戊醇混合液（9:1） 500 ml 450ml 氯仿+50ml 异戊醇 4. 95% 乙醇（实验前放入冰箱） 冷蒸馏水（实验前放入冰箱） SSC溶液 100ml （0.15M NaCl含0.015M柠檬酸三钠） 药品的配制： 7. SDS溶液 5g SDS溶于45%乙醇中配成100ml溶液 8. 水饱和酚 新鲜重蒸酚用水饱和 9. 2%醋酸钾-95%乙醇溶液 2g醋酸钾溶于95%乙醇中配成100ml溶液 三.操 作 步 骤 加缓冲液、绞碎、离心 称取新鲜（或冷冻）猪肝50g放入组织捣碎机中（先剪成 １cm小块），加入100ml 0.1mol/LNaCl,0.05mol/L, pH7.0 柠檬酸钠缓冲液，捣碎3min，组织糜于4000r/min离心 10min，将上清液与沉淀分开，保留上清液，将沉淀倒入烧 杯中，用上述缓冲液洗涤2次，每次50ml，如前离心 。合 并上清液。 A组取上清提 RNA ；B组取沉淀提 DNA A组：RNA的提取 1.? RNA-核蛋白的解聚 在上清液中加入5% SDS溶液，使SDS的最终浓度为0.5%左右,室温下摇匀.注意计算加入SDS的量的多少。 再在收集的水相中加等体积水饱和酚,同上步骤,抽 提去蛋白.如此重复2次,直至上下二相界面之间无蛋白 为止.小心吸取上层水相溶液,量取体积后置于烧杯中。 取2.5倍体积预冷的95%乙醇-2%醋酸钾溶液, 加入上述去蛋白的RNA溶液内,RNA沉淀，并以 4000r/min离心10 min，收集此沉淀。 取RNA溶液10ul，直接放入石英比色皿中，加水至比 色皿2/3以上处，用紫外分光光度计测定260nm和280nm吸 收值，计算两者吸收比值来鉴定其纯度。 纯的RNA，其OD260/OD280为2.0 B组：DNA的提取 1. 析出DNP 向得到的细胞核沉淀中加入125 ml 10%NaCl溶液， 充分混匀，搅拌10-15min, 于4000r/min离心15min。 将所得的半透明粘稠状液体，沿玻璃棒慢慢倒入10倍体 积的冷蒸馏水内，这时有白色丝状物-核蛋白DNP析出， 4000 r/min离心10min 。将沉淀物再溶于10%NaCl溶液中 （用量筒取50ml 10%NaCl，每次取少量溶解沉淀，逐步将 溶解液移至两个离心管中），迅速搅拌至充分溶解。 加入1/2体积氯仿-异戊醇混合液，剧烈振荡5min左 右，于4000r/min离心10min。得三层：上面为含有DNA和 DNA核蛋白的水层，下面为氯仿-异戊醇的有机溶剂层，变 性蛋白质凝胶介于两层之间。吸出上面的水层，用玻璃棒 挑出蛋白质凝胶层（前几次易挑出，当蛋白质含量少后不 易挑出时，可用吸管吸出蛋白层），将吸出的水层倒回原 离心管。如前振荡离心进行脱蛋白，直至界面处不再出现 蛋白质凝胶为止。从中取样测定。 吸出上清液并将它注入两倍体积的95%冰乙醇中。可见 到白色纤维状DNA沉淀。 4.DNA的测定 取DNA溶液20ul，直接放入石英比色皿中，加水至比色 皿2/3以上处，用紫外分光光度计测定260nm和280nm吸收 值，计算两者吸收比值来鉴定其纯度。 纯的DNA，其OD260/OD280应为1.8 DNA沉淀 DNA沉淀 * * 实验四 从猪肝中分离提取 DNA和RNA 学习、掌握分离制备DNA和RNA的原理及基本方法。 一 实验目的： 利用DNA和RNA的溶解特性不同而使二者分开。 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物（DNP）后，必须将蛋白质除去。动物和植物组织的DNP可溶于水或浓盐溶液,但在稀盐溶液中溶解度很低,而RNP则溶于稀盐溶液中.由此将DNP与RNP分开。 二 实验原理： 去蛋白方法有很多种，本实验采用异戊醇-