并通过筛选dna文库直接获得与靶序列相互作用蛋白的编码基因.ppt

分子生物学 大连大学生物工程学院 迟彦 SNP概述 单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism ,SNP) ： 基因组序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。 单体型（Haplotype)： 位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型。 相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后代。 SNP分类 基因编码区SNP（cSNP） 同义cSNP 非同义cSNP 基因调控区SNP （pSNP） 基因间随机非编码区（rSNP） 同义cSNP SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基和未突变碱基的含义相同。 非同义cSNP 碱基序列的改变可以使其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。 SNP检测技术 基因芯片 Taqman 技术 分析信标 焦磷酸测序 Taqman 技术原理 探针设计上，利用荧光共振能量转换 （FRET）技术，探针5和3端分别用特殊的染料标记，称为供体-受体染料对或引爆-猝灭 染料对。 正常情况下，由于探针5端荧光基团和3端猝灭基团紧邻在一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料而被猝灭，只有当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。 Taqman 技术 Taqman 技术 分子信标技术 分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位点。 分子信标技术 在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。 相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍。 焦磷酸测序法 核心： 由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应 四种酶分别为: DNA 聚合酶(DNA poly merase) ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 荧光素酶(luciferase) 双磷酸酶(apyrase) 反应底物 5’- 磷酰硫酸(adenosine 5’-phosphosulfate ,APS) 、荧光素(luciferin) , 具体原理 在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。 第1步： 1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。 第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。 第4步： 反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。 第5步： 加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 SNP应用 人类基因单体型图的绘制 SNP与疾病易感基因的相关性分析 指导用药与药物设计 cDNA差示分析法克隆基因-RDA 代表性差异分析 representational difference analysis RDA RDA RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。 RDA 因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差示分析前均经一个4