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Development of an extraction method for mycobacterialmetabolome analysis B.U. Jaki, S.G. Franzblau, S.H. Cho, G.F. Pauli Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41 (2006) 196–200 报告人：禤淑霞 摘要 破壁是研究分枝杆菌属（可引起结核病等疾病）细胞内代谢物的一个前提,文章以牛型分枝杆菌 (BCG)为模型微生物，对几个高效率的破壁方法进行了比较。以Ultra-Turax处理样品后,应用和比较了以下几个匀浆的方法：在冷冻液氮中机械研磨,以探头或杯形探角声波处理，在溶剂提取前以珠磨法处理提取物。然后用重量分析法、电子显微镜方法和核磁共振光谱来分析细胞提取物。 所有分析方法证明,冷冻处理过的细胞的声波处理比机械研磨效果好。而用探头的声波处理比用杯形探角的声波处理更能提高细胞破裂的效率。结合机械研磨和声波处理两种方法能得到最高的萃取物产量和多种化学物。 在代谢组分析中，所选择的方法是用液氮冷冻分枝杆菌细胞，机械研磨后以带探头的声波处理。 Introduction 代谢物组分析成为阐明有机体低分子量的化学组分的重要方法 任一代谢组学分析方法的首要就是从有机体中提取细胞物质，因此找到一种有效的破壁方法显得异常重要。不同的细菌的表面结构不同，必须根据种类间不同的生化和生理特征来选择不同的方法进行破壁。尽管很多机械破壁方法很有效，但对于分支杆菌来说这些方法都有内在的限制，因此也影响了代谢组的分析。如利用弗氏细胞压碎法可以在不破坏细胞亚结构的情况下破坏细胞壁，但缺点是不能提取到只能在细胞完全破碎后才能提取到的某些化学组分。而对于分枝杆菌就是为了得到细胞分馏物，分枝杆菌的细胞壁厚而复杂，成为研究的一大障碍。 分枝杆菌有着复杂的细胞壁结构：L-Rha-D-GlcNAc-P共价形成肽聚糖大核心，线性的呋喃半乳糖与高分枝的阿拉伯呋喃糖连接在一起形成分枝菌酸。 有必要结合几种破壁方法来对其进行研究 破壁方法 机械法 声波破碎：高强度破碎，处理时间，样品粘度 珠磨法：摩擦大，不能用有机溶剂 研磨：依赖于生物体种类、操作人的熟练技术、所耗时间 微波破碎：热效应，不利于热不稳定物质的提取 化学法 渗透方法、强碱溶解：造成样品污染、其化学组分可能与产物反应而造成下游分析中的假象。如芳烃族对UV测定造成干扰 研究内容 本实验用到BCG（牛型结核病菌），因为它与结核分枝杆菌结构相似而且已经灭毒有生物安全性 破壁方法 第一步：液氮冷冻细胞终止代谢 第二步：超声破碎 破碎所用的溶剂成为了提取物的一部分，因此经过这两步就起到淬灭和溶解作用。所用到的溶剂对于后续的极性提取起到至关重要的作用 分馏和分析细胞物质：比较细胞物质的提取方法的三个参数：镜检、化学组分多样性、定量/重量分析 Material and methods M. bovis, Romanian substrain I.C（罗马利亚菌种） 在Sauton培养基（培养结核杆菌）中把菌培养至对数期，收集菌体以磷酸盐缓冲液洗涤。干菌体(200 g)用Ultra-Turax?萃取，然后用CHCl3和MeOH溶解。 菌体分成6批，每批4g，用液氮冷冻研磨5min，然后分成三等份并准确称重。一份作为样品（g）另一份用杯形探角超声处理（gsc）；最后第三份用探头超声波处理（gsp） 另外还要12批经过Ultra-Turax? 处理的干菌体2g ，分别以杯形探角超声处理（sc）和探头超声处理（sp）。还有6批以珠磨法处理的样品（bb），见表一 全部样品，除了bb（含有大量的室腔和/或转子磨碎细胞），都用CHCl3 和MeOH 萃取 Electron microscopy、Gravimetry、 Sonicating 样品 g, gsc, gsp, sc, sp 和没有经过处理的细胞都用Hitachi S-3000N SEM来观察细胞表面形态 以AND?分析天平来进行重量分析，精确度到分析0.01 mg. 超声液体处理器(Misonix XL-2020 Sonicator?, 600 W). 每个样品(以10mL CHCl3溶解, 冰套) 以20 kHz 固定频率，60s三次。杯形探角超声处理是在冰浴中的高强度的超声处理，可以使样品在密闭的容器中得到充分的处理。而探头超声处理则从不接触到样品，而不会造成样品损失或交叉污染 NMR、Bead beating 以CHCl3 和 MeOH 提取出的萃取物30mg 分开两相：CHCl3–MeOH–H2O 系统, 分离, 浓缩，接着溶解在CHC