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一 种改良的茶树高质量RNA快速提取方法 李 娟 刘硕谦 刘仲华 黄建安 (湖南农业大学茶学教育部重点实验室 湖南长沙 410128) 摘 要：为了从富含多酚与多糖的茶树叶片中制备高质量的总RNA，作者在通用Tri--Reagent 的基础上进行改良，即在操作进行到沉淀KNA这一步时先加入1／2倍体积的高盐。再加入1／2倍体积的 异丙醇，以除去茶多糖的干扰；同时使整个操作过程在低温环境下迅速连贯地进行，以防止褐化效应 并减少RNA酶的污染。利用改良的方法所提取的茶树总KNA，经琼脂糖电泳鉴定，可见2条清晰的 28sKNA和18sP．NA谱带，且前者明显强于后者，表明RNA完整性好，无明显降解现象。 关键词：茶树；总RNA；提取方法；改良 从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是进行植物 1．2．2 RNA抽提方法 分子生物学研究的必要前提和关键。进行Noahem杂交分析、 (1)常规Tri-Reagent法 按试剂盒上提供的方法进行。 基因体外翻译、eDNA文库构建、eDNA末端快速扩增 (Rapi— (2)全程低温Tri-Reagent法 按试剂盒上提供的方法，提 damplificationofcDNA ends，RACE)、差异显示反转录PCR 取全过程于冰上操作，以保持低温条件，且整个过程迅速连贯。 (DifferentiM display reverse transcription-PCR，DDRT-PCR) (31改良 m—Reagent法 研钵于冰上预冷，快速取茶树冰 等研究时均需要高质量的RNA[12]0由于植物组织细胞具有坚 冻材料 (越冬老叶或1芽2叶嫩梢，约0．2g)置于研钵中，并 硬的细胞壁，而且富含多种次生代谢物，如多糖、多酚、蛋 迅速加人液氮研磨，研磨过程中及时补充液氮，迅速将材料 白质等物质，在细胞破碎后，这些物质将以不同的方式干扰 研磨成细粉，快速分装于2个冰上预冷的1．5mL去RNase的离心 RNA的提取，如酚类物质氧化后可使RNA活性丧失 ]，多糖 管中；每管迅速加入lmLTri—Reagent试剂，混匀，注意样品 可形成难溶胶状物质与RNA一起被沉淀 [4 。另外，在植物细 总体积不超过所用Tri—Reagent体积的10％，室温放置5min， 胞破碎后，细胞内的RNA酶 (RNase)以及操作体系中的 使其充分裂解；加人200~L氯仿，振荡混匀后室温放置 RNase均会对分离组分中的mRNA进行降解。因此，如何提取 15min；4℃、12000g离心15min；小心吸取上清液于另一新的 高质量的RNA是分子生物学研究的关键之一。 预冷的1．5mL去RNase的离心管中，加人2501~L高盐 (0．8M柠 茶树叶片中含有丰富的茶多酚、茶多糖及萜类化合物等 檬酸钠和1．2M氯化钠)，轻轻混匀，再加A2501~L异丙醇，室 次生代谢产物，茶多酚氧化后可与RNA不可逆的结合，容易 温放置lOmin；4℃、12000g离 ,8min；弃上清，加人lmL体积 使RNA褐化．降解。因此，要提取高质量的茶树RNA则需设 分数为75％ (去RNase水配置)的乙醇洗涤沉淀；4℃、7500g 法除去这些物质的干扰。本研究在常规Tri--Reagent法的基础 离 L,5min；弃上清，沉淀干燥5min；加A401~L去核酸酶水溶 上，根据茶树叶片的特性对提取方法进行改良，获得了完整 解沉淀，轻轻振荡，使其充分溶解；取部分用于浓度和质量 性好，纯度高的总RNA。 的检测，其余样品保存于一20℃备用。 1 材料与方法 (4)改 Tri--Reagent+PVP(不溶性聚乙烯吡咯烷酮)法 1．1 材料 先在研钵中加人适量水不溶性PVP，再按照方法 (3)的步骤 供试材料为安吉白茶1芽2叶嫩