分析仪器-第一章-课件.pptVIP

光分析仪器 主要内容 1.1 紫外－可见分光光度计 （自学） 1.2 荧光光谱仪 （8学时） 1.3 红外光谱仪 （自学） 1.4 激光拉曼光谱仪 （2学时） 4.1、荧光寿命 1821，首次记录了荧光现象。 1852，Stokes ，窐宁 、叶绿素，荧光是吸收后的发射光不是漫反射，猝灭现象。 1867，Goppelsorder 首次荧光分析，铝-桑色素配合物进行铝的测定。 19世纪末合成了一些有机染料，认识了荧光素、署红、多环芳烃600多种荧光物质。 光速的测定及磷光计的发明，测定时间间隔0.0001s, 不能测定荧光。 Kerr cell(克尔盒）和荧光寿命的测定。时间间隔0(荧光寿命通常在纳秒级）。电子快门，前后放置偏振滤光镜，不加电压光线不通过，加电压后，分子有序允许光线通过。 4.3、荧光寿命测定方法 1、时域法 用超短光脉冲(1-2ns)激发样品，测量样品在激发后荧光强度的衰减将规律，根据样品中各点的荧光强度衰减曲线来拟合分析荧光寿命值。 2、频域法 用强度按正弦规律调制的激光激发样品，荧光强度按正弦调制，两者频率相同，通过激光相对与荧光的相位差及解调系数来测定荧光寿命。 3、时间分辨荧光各向异性。 4、多光子激发。 荧光成像在医学上有很长的发展历史 。 只有两种荧光基团被美国食品和药物管理局（FDA）认可，应用于医学领域，分别是吲哚花青绿（IGG）和荧光素。 荧光素已经有三十年的应用史，最初是应用于眼科； 吲哚花青绿已经被用作眼科剂，并且作为肝功能剂有五十年的历史。 第三种荧光基团是罗丹明B，1966年得到认可并应用，但是在1987年因为和小鼠癌症有关而被禁止使用 。 这两种药物主要用于获得视网膜血管造影。要求相当高剂量。（荧光素和吲哚花青绿的单人剂量分别为500和40毫克） 虽然会发生过敏反应之类的副作用，但是特殊的器官毒性还没有被报道。 荧光探针用于医学成像的一般要求 用于医学成像的分子探针有以下要求 ： 波长 亮度 生物和光稳定性 药物动力学 5.1 波长 荧光基团需要激发光才可以发射光。 紫外区的激发光能引起组织损伤，近红外区的激发光能给组织加热。 蓝色和绿色激发光组织穿透性很差，使他们只能在表面组织或小的动物组织中成像 。 黄光或红光区（大约600nm），这些波长会有过量的荧光出现，因为有自动生成的内源性荧光。 5.1 波长 较低波长的激发光不能穿透组织产生散射光，所以即使散射波长在理论成像上是合适的，激发光也不能穿透较深组织。 激发光和散射光理想波长在650-900nm。在这个波程内，吸收和自发荧光都是最小的，所以光穿透是最大的 。 5.2 亮度 选择荧光基团需考虑的第二个因素是亮度 。 越明亮的试剂，穿透能力越强。但是，亮度的增加通常会导致探针尺寸的增长。例如，用于基因编码的绿色荧光蛋白基团在深层的可视化活体成像中是非常明亮的，但它非常大，有25-50kDa，难于连接，使得它对许多应用是不切实际的。 量子点也是非常明亮的，但是由于较大的尺寸而难于接上目标。其组成部分，例如硒和镉，都是重金属，其潜在的毒性问题必须考虑。 5.3 稳定性 荧光基团的稳定性是又一个需要考虑的因素 。 虽然这些分子在体外通常是稳定的，但是在体内的稳定性，尤其是在细胞内的内化作用之后，稳定性通常是值得商榷的。 一旦被内化到溶酶体内，大部分的荧光基团，除了罗丹明，包括荧光素，氟硼荧（BODIPY）和喹啉蓝衍生物，都会在数天内失去荧光。在罗丹明衍生物的案例中，荧光能维持至少一个星期的时间。 此外，大多数有机荧光基团被光漂白之后它们的荧光能力会受到威胁。因此，当连续性观察是必须之时，有机荧光探针必须反复被注射。而且在体外成功可能无法预知在体内成功，因为试剂的生物半衰期可能太快，起不到作用。 5.3 稳定性 从运动的角度来看，一定水平的降解是合理的，因为这样产品就能够排泄出来。 例如量子点，代谢起来非常慢，用于临床必须完全的排泄出来。 稳定性不仅取决于荧光基团，而且也取决于其偶合物。一旦荧光基团通过一个连接器分子偶合到靶向配体，其稳定性可能会因为由分解代谢而产生的药物动力学改变而受到损害。 例如，一个荧光基团自身可能被迅速的排泄出去，但是当将其与一个大的载体分子连接时，将会在体内存在更长的时间，从而产生不可预见的可能对荧光有害的作用。 5.4 药物动力学 大部分小分子荧光基团都能改变与之共轭的靶标基团的药物代谢动力学，如多肽和蛋白质，尤其是当一个以上的荧光基团连接到目标共轭配体上时。 例如，当几个荧光基团，如罗丹明