细胞培养基本知识-课件.pptVIP

细胞培养 2011/11/11 申艳娜 shenyanna@ 教材 细胞培养 （Cell culture） 司徒镇强 任教老师 申艳娜 shenyanna@ 岳丹 yuedan1980@ 李晓蕾 leileili1225@ 授课 6次理论课+2次实验课 细胞培养 细胞培养(cell culture): 动植物细胞在体外培养的条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 　 细胞培养分为动物细胞培养和植物细胞培养，其中动物细胞培养是指在体外无菌条件下，模拟体内正常生理状态下的基本条件和环境，分离培养机体组织细胞或建立细胞系，并使得细胞在体外培养容器中长期生长或繁殖的方法。 应用领域广泛 病毒学 免疫学 遗传学 肿瘤学 分化及发育 细胞毒试验 临床医学及生物技术 第一章 细胞培养的基本知识 1.掌握培养细胞的生长特点和生长条件。 2. 熟悉培养细胞的特性。 第二章 细胞培养室的设置、设备和准备工作 1.掌握细胞培养实验室的设备使用方法和保养。 2.掌握实验器材的清洗和消毒灭菌方法。 3.了解细胞培养实验室的设置。 细胞培养的基本知识 体外培养细胞的分型  贴附型 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依 赖性细胞，大致分成以下四型： 成纤维细胞 上皮型细胞 游走细胞型 多型细胞型 1、成纤维细胞型 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 　　　真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 　　　血管内皮 形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等 的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维 样细胞，常有几个伸长的细胞突起 2、上皮型细胞 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆 　　　形核 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状 　　　生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动 4、多型细胞型 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 悬浮型 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 　　　易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细 　　　胞)  每代贴壁细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 首次传代注意事项 细胞生长密度不高时，不能急于传代 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 首次传代时细胞接种数量要多一些 首次传代培养的pH应偏低些 小牛血清浓度可加大至15%～20%左右 细胞计数 计数结果以每毫升细胞数表示 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 细胞计数步骤 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。　 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。 　　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104 注意：压线细胞只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算