腺相关病毒细胞感染手册.pdfVIP

腺相关病毒 （AAV）感染目的细胞 腺相关病毒 （AAV）感染目的细胞 Adeno-Associated Viral Vector AAV 一、腺相关病毒 （ ， ） 简介 腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA 病 毒。AAV 的基因组约 4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于 分别由145 个核苷酸组成的2 个反向末端重复序列(ITR)之间。 基因组中有3 个启动子(P5、P19 和P40) 和2 个开放阅读读框(ORF)， rep 和 cap，如图1 所示。rep 编码4 个重叠的多功能蛋白，即Rep78、 Rep68、Rep52 和Rep40，其中Rep78 与Rep68 参与AAV 的复制与整合， Rep52 和Rep40 具有解螺旋酶和ATP 酶活性，与Rep78、Rep68 共同参与 单链基因组的复制；cap 编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣 壳蛋白，它们在AAV 病毒整合、复制和装配中其重要作用。 图1. AAV 基因结构 二、腺相关病毒的优点 1. 安全性高：迄今从未发现野生型AAV 对人体致病，重组AAV 基因组序 列上去除了大部分的野生型AAV 基因组元件，进一步保证了安全性； 2. 免疫原性低：AAV2 的基因组仅4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小； 3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞； 4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达； 5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿； 三、重组腺相关病毒载体不同血清型 研究发现AAV 具有多种血清型，各种不同血清型的AAV 载体的主要区 别是 衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前 汉恒生物 在包装腺相关病毒时有 9 中不同的 AAV 血清型可供客户选 择，建议客户针对不同 组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒，见表 1。 四、AAV 感染目的细胞 不同的AAV 血清型对不同的细胞有相对的亲和力，因此，对于 AAV 来说，不同类型的细胞的侵染实验，首先需要确定合适的AAV 血清型，在此基础上进行最适MOI 的摸索。 （一）关于最适血清型摸索 下图以AAV-2 为标准侵染分数 （100分），给出了不同的AAV 血清型对于不同细胞的侵染能力，比如Huh-7，DJ 型为500，意味 着DJ 对与Huh-7 的侵染能力是AAV-2 的5倍，部分细胞的侵染血 清型确定可根据下表来确定，但我们仍建议在进行正式实验之前，进 行最适血清型的预实验摸索。大部分细胞来说，AAV-DJ 是AAV 血 清型里侵染细胞能力最强的一组血清型。 （二）关于最适MOI摸索 MOI （Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的 病毒数。通常MOI越高，AAV 病毒感染后宿主细胞内保留的腺病毒 基因组数量以及目的蛋白的表达量越高。 4 AAV 对离体细胞的感染能力比较有限，所需病毒MOI大于10 ， 通过选择合适的血清型并使用合适的病毒感染MOI仍然可以达到一 定的感染效果。 AAV 病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别， 原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。每种细胞对应每种类 型的病毒都应该进行最适MOI摸索实验，设置MOI梯度摸索实验， 4 5 选择适合的MOI进行实验。AAV 细胞感染的MOI一般以10 ：10 ： 6 10 进行梯度摸索。 （三）感染步骤： 1. 细胞培养： 将状态良好的目的细胞接种到细胞培养皿中，尽量使用小孔培养 皿 （24 孔板或者48孔板），接种细胞数量因细胞的生长速度而略