2014分子生物学实验课.ppt

* 动画效果 * 动画效果 【实验原理】 荧光嵌入燃料如溴化乙锭分子嵌入DNA分子中形成络合物，由于溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，从而在紫外线下直接观察DNA条带在凝胶中的位置。 【试剂与器材】 低熔点琼脂糖（约65℃熔化 ） 5×TBE电泳缓冲液 溴化乙锭（EB） 稳压稳流电泳仪 水平电泳槽及点样梳 溶液Ⅳ（加样缓冲液） 【实验步骤】 1.配制0.7%低熔点琼脂糖溶液； 2.冷却至55℃左右，加入EB（0.5ug/mL），摇动混匀； 3.用胶带围封电泳板两端，平置，插好点样梳，将温热的琼脂糖溶液倒入电泳板中，冷却后放4℃冰箱10-20min； 4.拔出梳子，撕去胶带，将电泳板放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液500mL; 5.加5uL溶液Ⅳ于DNA样品管中，混匀，取20uL混合液加入加样孔中（潜水式加样）； 6.盖上电泳槽盖，接好电源线，打开电源开关，以1-5V/cm电压电泳， 7.在紫外分析仪的玻璃平板上观察电泳结果。 注意事项 1、应在琼脂糖应完全融化后制胶，倒胶时要避免产生气泡，若有气泡要用吸管吸去； 2、EB为强诱变剂，有致癌作用； 3、加样孔容积决定最大加样量，切忌加样孔中样品过多而溢出； 4、采用低电压、长时间电泳，可以得到分辨率较好、带型整齐的电泳图谱。 实验四DNA片段的回收与重组连接 【实验目的】 了解：DNA片段的回收与重组连接的原理。 掌握：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法及 DNA重组连接技术。 【实验原理】 DNA片段的回收： 质粒、噬菌体等经酶切后，DNA片段需要纯化。常将酶切产物电泳后，从凝胶中将合适大小的DNA片段进行回收和纯化。 【实验原理】 DNA的重组连接： 在Mg2+和ATP存在下，T4-DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。 联接反应的影响因素包括温度、时间、酶量、缓冲系统、DNA末端的性质级浓度、DNA片段的大小等。 【试剂与器材】 紫外分析仪 T4DNA连接酶 DNA片段的回收： 1.在紫外灯下，从凝胶中切下含有待回收DNA的胶条，大小片段分开放置于EP管中，65℃孵育5min，捣碎； 2.加入300uL TE液，摇匀； 3.用DNA分离纯化的方法沉淀DNA。 DNA的重组连接： 1.10uL的反应体系中依次加入：目的DNA(小片段)3uL;载体（大片段）1uL;蒸馏水4uL；10×Buffer 1uL； T4DNA连接酶 1uL 2.用封口膜封口，混匀，12000r/min离心2min，16℃反应过夜。 【实验步骤】 注意事项 1.紫外灯下切下待回收DNA的凝胶时，应尽量减小含目的DNA片段胶块的体积，切割时间不超过30S； 2.紫外灯下切下待回收DNA凝胶时，防止外源DNA的污染； 3.为保证目的DNA片段装载到载体上，最好目的DNA片段的分子数/载体分子数﹥3； 4.连接酶的最佳反应温度是16℃。 质粒DNA的分离纯化 加等体积氯仿（振荡混匀），12000rpm 5min, 上层水相转至新EP管，重复一次 ? 加1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积无水乙醇（充分 混匀），-20℃ 10min，12000rpm 10min，弃上清 ? 加1ml预冷70%乙醇（轻弹混匀），12000rpm 5min,弃上清将EP管倒置于滤纸上，室温敞口，10-15min ? 加入10?l蒸馏水，溶解沉淀，待用 实验五 感受态细胞的制备（CaCl2）与转化 【实验原理】 CaCl2法制备感受态细胞的原理是：细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，待转化DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。 在营养丰富的培养基上生长数小时后，受体细菌分裂增殖，被转化到细菌细胞中的重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上，可筛选出所需的阳性转化子。 【试剂与器材】 DH5α菌 0.1mol/L CaCl2溶液 含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂培养平板 往复式恒温摇床 【实验步骤】 受体菌的培养 ? 感受态细胞的制备（CaCl2法） ? 质粒DNA的转化 受体菌的培养 取一环冷冻保存的菌种（DH5α）接种于不含抗生素的琼脂糖平板上，倒置37℃培养过夜 ? 取单个菌落，接种于LB液体培养 基中，37℃振荡过夜 感受态细胞的制备（CaCl2法） 取4mL菌液于5mL生化管中，冰浴10min， 4℃下4000rpm离心10min，弃上清，吸去残留液体 ? 加1.5mL冰预冷0.1mol/L CaCl2溶液， 轻轻混悬细胞后转入Ep管中，冰浴10min， 4℃下4000rpm离心10min，弃上清