Nuclear magnetic resonance - 现代生物学仪器分析 - 武汉大学.PDF

电镜三维重构 (Electron microscopy and three- dimensional image reconstruction) 梁 毅 (武汉大学生命科学学院) 现代生物学仪器分析中的 “四大谱”和 “三大法”  生物分子的结构分析传统上最有效的方法 是 “四大谱”：  紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振波谱 和质谱  生物大分子（蛋白质和核酸等）结构测定 的最重要和应用最广泛的三大方法：  X射线晶体衍射分析、核磁共振波谱分析 和电镜三维重构 什么是电镜？ 电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用 电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的 细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器  电镜用于生物样品的结构研究是众所周 知的，目前高分辨率的电镜可以达到0.l nm乃至3 Å水平，这是指在特定条件下 可分辨的两点的距离。  虽然这已接近原子分辨水平，但由于种 种原因要看到构成生物大分子的碳、氢、 氧原子的三维排布仍是很困难的。  首先，构成生物物质的碳、氢、氧、氮等 元素对电子的散射能力较弱； 其次高速电子的轰击会对生物样品造成辐 射损伤，后者在生物样品的高分辨率结构 分析中是最严重的问题。 损伤机制包括非弹性散射引起的化学键断 裂，也包括电子轰击引起离子、自由基和 分子碎片扩散，从而造成生物样品的质量 损失。  因此利用电子显微镜对生物大分子进行 研究必须首先把观察对象制备成特殊的 样品。  电镜的样品制备方法有许多种，在有关 生物大分子结构研究中，负染、葡萄糖 包埋以及冰冻含水等方法是常用的。 电镜载网  电镜观察的样品需要在特制的金属载网上才能送入电镜镜筒中进 行观察。载网的直径通常为4 mm ，可以用铜、银、铂、镍等金 属或铜镍、银镍合金等制成。最常用的载网为铜制的，所以电镜 载网一般又称作电镜铜网。  铜网网孔的形状多样，有圆形的、方形的、单孔形和狭缝形；网 孔的数目有50 目、100 目、200 目、300 目和400 目等多种规格。网 孔越大，观察的有效面积越大，但同时对样品的支持稳定性也越 差。在电子晶体学电镜观察中最常用的是200 目和400 目的铜网。  铜网在使用前要经过预处理，先用丙酮，后用无水乙醇清洗，以 除去铜网上的油污。清洁后的铜网要真空干燥后才能制备覆盖的 支撑膜。 负染  理想中我们希望能够获得一个生物大分子完整的、具 有尽可能高分辨率的三维结构，而样品制备技术就是 开始的第一步。  生物大分子大都含水，要将水化的大分子尽可能地稳 定保持使它可以在电子显微镜高真空的镜筒中保持原 有结构。  同时，生物大分子样品主要是由碳、氢、氧、氮等轻 元素原子组成，对电子散射能力很弱，因此样品本身 可以提供的衬度很低，一般很难直接观察到，于是人 们发展了一些衬度增强技术来加强样品的衬度。  负染法是最常用的衬度增强技术。  负染技术就是用一些重金属盐，如醋酸铀来加强样品 的衬度，保护分子结构不被电子束损伤。  当用重金属盐溶液染色生物样品时，重金属盐沉淀在 样品四周，如果样品本身表面有凹凸，溶液还能积存 在凹陷的部分。  在重金属盐沉淀的区域，电子的散射能力强，使样品 四周出现暗环，而在有样品的区域，电子的散射能力 弱，表现为亮区。这样就把样品的外形及表面结构衬 托出来。 样品包埋  随着高分辨率电镜技术的发展，人们可以从衬 度很弱的图像中读出分子本身的信息。但是这 种生物学意义上的信息都必须在使用一些特殊 的样品支持介质后才能获取。这些样品支持介 质是一些和生物大分子自身水化环境十分接近 的包埋物质，如葡萄糖、单宁酸和无序冰。