如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子.ppt

10级临床七年二班 第五组 背景介绍：生物大分子 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。 生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，例如蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸等。 蛋白质、核酸和多糖是3类主要的生物大分子，它们在分子结构和生理功能上差别很大，然而，在以下几个方面又显出共性： 在活细胞内，生物大分子和相应的生物小分子之间的互变，通常通过脱水缩合，或加水分解。 蛋白质链（或称肽链）、核酸链和糖链都有方向性，尽管方向性的体现各不相同。 蛋白质、核酸和多糖分子都有各具特征的高级结构，正确的高级结构是生物大分子执行其生物功能的必要前提。 在活细胞中，生物大分子互相密切配合，共同参与生命过程，甚至很多情况下形成生命活动必不可少的复合大分子，如核蛋白、糖蛋白。 通用的技术路线设计方案 1. 确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求 不论是学生学习简单的分离提纯方法，还是科研人员进行研究、开发或者探索新物质，一个明确的目的和要求都是必不可少的。本课题要求对生物大分子进行分离提纯，也即在了解生物大分子（即蛋白质、核酸、脂质、糖类）的前提下，进行尽可能完善的提纯，同时也应注意满足现实设备情况。 2. 建立相应可靠的分析测定方法 分离提纯最为重要的就是最终的“纯度”，所以一套完善可靠地分析测定方法就是进行工作的前提条件。没有这双“眼睛”，将无法得到最终的实验结果。 3. 查阅文献调研和预备性实验 要进行分离提纯就必须掌握四种生物大分子的一般理化性质以及需要提纯的产物的一些特殊理化性质，只有这样才能进行分离提纯的工作。 4. 生物材料的破碎和处理 需要分离的生物大分子往往贮存在生物体内，而根据生物种类的不同，如微生物、动物、植物等，有不同的生物材料处理方式，而处理方式的得当与否，往往也决定着最终的提取率的高低甚至实验的可行性。 5.分离纯化方案的选择和探索 同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。 6.生物大分子纯度的检测 根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。 7.产物的浓缩、干燥与保存 常用的检测方法 物理、化学方法： 比色法、气相/液相色谱法、 光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法） 、 电泳法、以及核磁共振等。但应注意，如果实验对精确性要求较高则必须同时采用 2-3 种不同的纯度鉴定法才能确定。 生物学的测定法： 酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 实验需要了解的理化性质 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 固态时和冻干时的稳定性。 物理性质： 分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、 离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。 化学性质： 对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力等。 各种生物大分子进行分离提纯的技术路线要点 1.核酸的分离纯化 分离纯化原则： 保持核酸分子一级结构的完整性 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力。 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物 ② 分离纯化的步骤： 取材：核酸在细胞内部，所以需要破碎细胞才能取得核酸，常用方法如下：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等） 除杂： 肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死；加入淀粉酶；在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA