课堂讨论5 用X 线衍射，核磁共振(NMR)和电镜冷冻蚀刻技术(Cryo-EM.PDF

课堂讨论5 用X 线衍射，核磁共振(NMR)和电镜冷冻蚀刻技术(Cryo-EM)确定大分子结构的方法。 这三种方法都很重要。 评价它们的标准有空间分辨率 （能看到什么结构？单个C －C 键？或只是蛋白质的总体外 形？），时间分辨率（只是一个快照？还是蛋白随时间变化的动态信息？），天然状态的维持 （分析可溶性蛋白是在37℃的水浴中吗？或样品需要冷冻或结晶吗？）以及样品的要求（包 括纯度，量，复杂程度）。 X-线晶体学 ― 概述：获得极纯的均一样品，并使之结晶。 用X 线照射晶体，检测仪记录其衍射图，并用计算机重建分子的原子结构。 ― 原子分辨能力―能看到单个原子和化学键，最小分辨率可达到~1Å 。这是因为X 线 波长与化学键长相近（不同于可见光，可见光波长约 5000Å ），因此其结构可用 X 线“看到”。 ― 没有时间信息：是蛋白质结构的静态快照，没有动态中间物等。 ― 操作流程： 获得极纯的样品。用常规法使之结晶（通常用悬滴法）； 快速将晶体降到接近液氮的温度，以减少热力学振动（增加分辨率）； 将晶体固定在一个针上，并置于X-线光路中； 用X 线照射，用检测仪记录衍射图； 旋转晶体，收集更多的衍射图； 将同一晶体浸在重金属离子中，并重复上述实验； 通过电脑计算，将衍射图转换成二维电子密度图，显示原子的位置（注意：因 为H 仅有一个电子，因此很难确定 H 的位置）。重金属晶体是用于定相，或确 定衍射图上形成每一点的波的相位―这对获得电子密度图很重要。 结合多个二维图，得出三维图像； 用已知的氨基酸序列及结构合理的相关知识，构建一个符合衍射图像的蛋白模 型。（“模型构建”和“模型精制”过程） R 因子：金标准 0.59 = 随机（0.35~0.55 = 典型的精制前的初始模型） ＞0.25 = 可能是全面的折叠错误 ＞0.2 = 不错，可能有一些侧链错误 ＜0.2 = 很好，没有大的问题 Rfree = 精制前对数据中的随机子集（5% ）计算得出的R ；应0.3 且在R 因子 的10%内。 ― 优点： 分辨率最高 研究时对蛋白没有大小限制（相对于NMR ） ― 缺点： 生成蛋白结晶在技术上较难。如非均一样品、膜蛋白、蛋白质复合物都很难结 晶。 只能做静态快照。 NMR （核磁共振） ― 概述：将13 15 C和/或 N标记的蛋白溶液置入一个强磁场中。通过外加磁场，可测出键 13 15 间（J偶合）和位置间（NoE ）的偶合常数。这样可提供 C原子间或 N原子间的距 离，从而获得蛋白质的结构模型。 ― NMR利用非零旋转（1 13 15 H ， C， N ）可探测到原子核的化学位移。这种位移取决于 原子核的电子环境，也就是说，与其周围原子的性质和距离有关。 ― 通过测得质子对之间的键间（标量或J 偶合）或空间（原子核欧沃豪斯效应，NOE ） 磁化位移，可以得到蛋白质的结构信息。间隔于三个及以下共价键的质子对的 J 偶 合可以测得到。NOE 的强度与质子对间距离的六次方成反比，NOE 的强度一般在质 子对的距离5Å 时可检测到。 ― NMR 实验结果是蛋白质全面的结构模型，而不是单一结构。 ― 操作流程： 13 15 用 C和/或 N标记蛋白质； 浓缩蛋白质的水溶液（0.21~1 mM，6~30 mg/mL ）；