荧光原位杂交-幻灯片.pptVIP

L/O/G/O 荧光原位杂交（FISH） Fluorescence in situ hybridization 以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。 FISH原理 FISH发展 1969年，同位素标记的DNA探针； 1974年，染色体显带技术与原位杂交结合； 1981年，荧光素标记的cDNA探针； 90年代后，多色探针出现。 探针的发展 放射性标记：很难满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的条件，灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（P32），档标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低；如果使用低辐射能的放射性标记物（3H）可以得到较高分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致北京过高而难以分辨出真正信号。 非放射性标记：常用的有生物素与荧光素。生物素一般通过连接到 dUTP 等核苷三磷酸上，这种经修饰的核苷三磷酸再通过酶促反应掺入到探针中；荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下掺入到探针中去，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等 探针制备 所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其他标记物（如酶与荧光素等）标记的与目的基因互补的 DNA 片段或单链 DNA 或 RNA。根据其来源可分为“cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针与 RNA 探针”。 1.“cDNA探针” 以 mRNA 为模板——在逆转录酶的催化下合成一条与 mRNA 互补的DNA链（cDNA）——用碱除去mRNA 2.“基因组探针”是把染色体DNA通过超声击断或以限制性内切酶不完全水解——获得许多染色体DNA随机片段——择长度约15-20kb（千对碱基）的DNA片段重组到λ噬菌体中——经体外包装转染大肠杆菌——筛选出含目的基因的大肠杆菌——扩增后提取质粒—— 酶切分离目的基因。   3.“寡核苷酸探针”为人工合成的DNA片段，一般长约20-50个bp（碱基）。可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针；如不知核酸序列，可依据其蛋白产物的氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。由于DNA自动合成仪的出现使探针的合成十分方便。 4.“RNA探针”制备的技术路线为：将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质粒的多克隆位点——以内切酶在插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一部位消化重组质粒——使之成为线性DNA——在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。由于RNA探针为单链，杂交时不存在第二条链的竞争，所以其敏感性较经缺口平移标记的DNA探针要高。  探针的非放射性标记 间接标记：是采用生物素标记DNA探针，杂交 后再用联有荧光素的抗生物素抗体检测。（可将检测信号放大，监测到小至５00 bｐ的靶序列） 直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷酸或 磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时掺入荧光素核苷三磷酸标记探针。（检测步骤简单，但不能将信号放大，不如间接标记的探针灵敏） 切口平移法： 切口平移标记法先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口，大肠杆菌 DNA聚合酶I 作用以切口处开始，以另一条DNA链为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。 （引物延伸法） 本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3’-OH的末端开始合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模序列互补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3’-OH端。 探针类型 1、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵母人工染色体、细菌人工染色体，主要用以识别染色体的易位、缺失和扩增。 2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检测染色体数目或结构异常。 3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA 重复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异常。  染色体涂染探针：判断易位染色体 8号染色体探针 α-卫星DNA是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着丝粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝粒DNA区域