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HPLC仪器 二、 进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。 1、要求： 粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压 化学稳定性好 HPLC的固定相和流动相 一、固定相 一、固定相 （1） 按承受压力分 刚性固体：硅胶为基质 主要用于吸附、分配和键合色谱 硬 胶：以聚合物为基质 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱 2、固定相载体 （2）按孔隙深度分 表面多孔型：实心玻璃珠为基体，基体表面覆盖一层多孔活性材料 适于常规分离分析 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成 适于复杂混合物的分离。 一、固定相 2、固定相载体 3. 常用固定相 液固色谱固定相 常用粒径3~10μm，理论塔板数过 5 万/米 无定形全多孔硅胶：YWG 球形全多孔硅胶：YQG 高分子多孔微球：YSG 一、固定相 3. 常用固定相 化学键合固定相 以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上 一、固定相 Si-O-R： 热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相 Si-R(或Si-N)： 不水解，热稳定性较好。但格式反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。 Si-O-Si-R： 不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定 3. 常用固定相 化学键合固定相 一、固定相 3. 常用固定相 化学键合固定相 非极性键合相：十八烷基键合相（ODS，C18） 中等极性键合相：醚基键合相 极性键合相：氨基、氰基键合相 一、固定相 3. 常用固定相 其它固定相 离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂 空间排阻色谱固定相：凝胶 手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精 亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体 一、固定相 二、流动相——淋洗液，洗脱剂 对样品有适宜溶解度， k = 2 ~ 5； 溶剂要与检测器匹配。 高纯度、化学稳定性好 适宜的粘度。过高柱压增加；过低易生气泡 1、流动相要求 常用的低粘度溶剂：甲醇、乙晴等 粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等 正相色谱：极性固定相——非极性流动相（加极性调节剂如氯仿）——极性柱（正相柱） 三、固定相和流动相的选择 反相色谱：非极性键合固定相（ODS）——极性流动相——非极性柱（反相柱） 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 流动相可选水或一定pH缓冲液，加甲醇或乙腈调节极性） HPLC分离条件的选择 在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u （1）固定相： ①粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力； ②改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。 HPLC分离条件的选择 （2）流动相： 低粘度的流动相——增大组分 在溶剂中的扩散系数Dm——减少传质阻力 （3）流速： 最佳流速在流速很小处，减小流速有利提高柱效 常采用比最佳流速高数倍的流速——加快分析速度 第四节 HPLC分离条件的选择 （4）柱温： 提高柱温——降低流动相粘度——减少传质阻力——分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡， 一般在室温下进行 HPLC分离条件的选择 建立HPLC分析方法的一般步骤 建立HPLC分析方法的一般步骤 2、选择合适的分析方法 适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径） 流动相 检测器 样品预处理 建立HPLC分析方法的一般步骤 3.分析条件的优化 流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量 建立HPLC分析方法的一般步骤 4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 4、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测： 合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等 天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等 5、在无机分析中的应用 阳、阴离子的分析等。 HPLC的应用 * 使用手动进样器时要注意以下事项： 进样针：应选用液相专用的平头针。 进样量：要么小于定量环体积的一半, 要么满刻度进样(需要推进3~5倍定量环体积的样品)。 进样动作：在Load状态下推针，动作要平缓，以防样品冲