酶联免疫吸附实验讲义研究.ppt

2010年吕梁市兽医实验室培训 酶联免疫吸附试验 Enzyme linked immunosorbent assay ELISA 1、酶联免疫吸附测定法（ELISA）简介 1.1、基本概念：抗原、抗体、抗原抗体的特性 1.2、ELISA方法简介： 1.3、ELISA方法的原理 1.4、ELISA方法的分类 2、ELISA试剂的组成 2.1、 ELISA试剂盒的组成 2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；2.1.2、酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；2.1.3、酶的底物；2.1.4、参考标准品（定量测定）；2.1.5、酶标记物及样本的稀释液；2.1.6、洗涤液；2.1.7、酶反应终止液。 3、ELISA实验过程 3.1 、试剂的准备3.2 、加样3.3 、保温3.4、 洗涤3.5 、显色和比色 4、ELISA试验的质量控制 4.1 分析前质控4.1.1 人员培训??4.1.2 仪器质控 4.1.3 标本采集及处理过程的质控 4.2 分析中质控 2、ELISA试剂的组成 2.1、 ELISA试剂盒的组成 2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；2.1.2、酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；2.1.3、酶的底物；2.1.4、参考标准品（定量测定）；2.1.5、酶标记物及样本的稀释液；2.1.6、洗涤液；2.1.7、酶反应终止液。 3、ELISA实验过程 3.1 、试剂的准备3.2 、加样3.3 、保温3.4、 洗涤3.5 、显色和比色 4、ELISA试验的质量控制 5、胶体金试纸 5.1、免疫层析法简介及特点 5.2、免疫层析法的结构及原理 二、培训内容（操作部分） 6、操作过程演示 7、计算软件应用说明 1、酶联免疫吸附反应法（ELISA） 1.1、基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性 1.2、ELISA方法简介 ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和微生物检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于病原微生物以及食品中抗生素检测的试剂盒产品。 1.3、ELISA方法的原理 基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。 1.4、ELISA方法的分类 直接法： 直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图2-17（a） 间接性ELISA 是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。 间接性ELISA原理： 夹心法 是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。 双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp) 液相阻断ELISA 用于检抗体，得到的结果比间接ELISA可靠。其过程如下： 抗原包被酶标板，加待检血清，后加酶标抗体，底物显色，终止。 如果待检样阳性则与酶标板上包被的抗原结合，阻断酶标抗体与其反应。 结果OD越高，为阴性