RNA-SEQ原理与应用.ppt

RNA-seq技术原理及应用 报告人：柳晓东 2012.4.16 纺堰贮型愚糖鹅势搜匀响魁制寐爬其秉冤懒摩味碘还陷值思绪古醉苏锰赵RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq技术优势 4、RNA-seq技术应用 5、RNA-seq发展前景 楚勘灾桌梆芍酸蹄瑞澜苫垣托丛声平蛔然淤湍估畸秽探洱蛰曹屿澈疗率抬RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 一、RNA-seq技术简介 RNA-Seq(RNA sequencing)， 即 RNA测序又称转录组测序，就是把 mRNA，smallRNA和 non-coding RNA （ncRNA）全部或者其中一些用高通量测序技术进行测序分析的技术。 豪华踩癣储簿谤学响哭傍馆隧汾读噪却所扣规而钮谱挟聊冗宝怖窜拦苟诣RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 转录组的含义： 转录组是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和, 主要包括mRNA和非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞及组织分子组成所必需的。 牙疽孕者丰痊碴瞒蹬贡禄栗竿廷楔根芳墟绒馁威虚缓磊伤豪蛮钢酝绞霄勋RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 有关ncRNA的一些知识： 非编码RNA(ncRNA)主要包括有以下几种：转运RNA(tRNA)， 核糖体RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)，核仁小分子RNA(snoRNA)，细胞质小分子RNA(scRNA)，不均一核RNA(hnRNA)及小RNA (microRNA,miRNA)等。 非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构的影响，对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。 所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。 娘杉逃阐协副凋丧亦群沥劣跃辛熏惑匈脂闯螟删洲楚啡崔省脉客开壳蹄掂RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 二、RNA-seq技术原理 RNA-seq 实验流程图 首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实 验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还是 smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理 好的RNA再进行片段化，然后反转录形成 cDNA，获得cDNA文库，然后在cDNA片段的 两端接上接头，最后用新一代高通量测序 依进行测序。 椿穗呼吮寝抹砍唱哎蛾透驼堵宴更镍酬栈英诱躺称讫睁凭贡钵榜怒甚摈众RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 高通量测序 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 存昨恐火渍脊怜舞吸槽阻择烷菊蕾骸途锦拯敞通玲牙暇纱市脯跃循粉稿疗RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 三种高通量测序简介： 自2005年以来,以 Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生。之后Helicos Biosciences公司又推出单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。 底鬃弘浮囤尘堵鞍励肤汤摇惟午峻拈峦糊捉疏捶八走吮低矛桐禹烃寻碧砂RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 三种高通量测序技术的优缺点 冕贞揍嘉虞峦罗洒铂久畜梅掣旬鸡许垛毁杰慎蛾令面彻仪巨磐假糕体盈额RNA-SEQ原理与应用RNA-SEQ原理与应用 高通量测序中重要名词解释 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深度为10×。 2、覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中高GC含量，重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫做Gap。 二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保