慢病毒介导RNAi技术.doc

慢病毒介导的RNAi技术 概述 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中。由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转入细胞内转录siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点： ● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。 ● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。 ● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin可以在2-3天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。 慢病毒表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21nt RNA和～50nt RNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。慢病毒介导的RNAi和其它方法的比较见图 1。 pLKO.1载体 美国RNAi协作组（The RNAi Consortium）已经利用pLKO.1载体骨架构建了针对15,000个人类基因和15,000小鼠基因的shRNA库，详细信息见文献Moffat et al., Cell 2006 Mar; 124(6): 1283-98。pLKO.1是一种复制缺陷型慢病毒载体，它可以直接通过转染操作被导入细胞，作为常规RNAi载体使用，也可被包装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。一旦进入细胞，整合到基因组，便可以稳定表达shRNA和具有Puromycin抗性，Puromycin筛选可以杀死没有稳定整合慢病毒载体的细胞，得到稳定整合的细胞系。图 2，3分别为pLKO.1载体的图谱和shRNA的示意图。 元件 注释 5’ LTR 5’ 长末端重复序列（long terminal repeat） RRE Rev反应元件，介导转录本出核，从而被有效包装 U6 人类U6启动子，RNA聚合酶Ⅲ可以识别，指导下游shRNA转录 shRNA insert 小发卡RNA插入片断 cPPT Central polypurine tract，促进载体片断入核，提高整合效率 hPGK 人类磷酸甘油激酶启动子，指导puromycin抗性基因的组成性表达 Puro R 表达的蛋白使细胞具有puromycin抗性，方便选择 sin 3’ LTR 3’ 失活长末端重复序列 F1 ori f1细菌复制起点 Amp R 氨苄青霉素抗性基因 pUC ori pUC细菌复制起点 shRNA寡核苷酸序列的设计和合成 A. 设计 确定一段合适的21个碱基的靶序列是有效的敲低某个基因的非常重要的第一步。现在一些互联网上的服务器能够帮助提供一些线索。例如，由Whitehead生物医学研究所（The Whitehead Institute for Biomedical Research）设立和维护的siRNAext程序（/siRNAext），登记个人信息后，便可免费使用。下面为一些设计siRNA的基本原则： 1. 从起始密码ATG下