大肠杆菌血脑屏障侵袭基因ibeb的功能分析.pdfVIP

进入真核细胞并发挥作用。 最近，本实验室观察到一个新的现象：将ibeB基因转染至鼠胚胎干细 胞后可以引起类神经细胞的形态变化，以及触发神经干细胞前体细胞的标 志性蛋白——Nestin的表达。 基于此，本研究采I钼gsN转染的方法，利用真核表达载体，对ibeB基因 在人宫颈癌上皮细艟(Hela)中的高表达所产生的影响进行了研究。通过 响．并对IbeB蛋白发挥作用的分子机制进行了探讨。 方 法 l真核表达载体的构建 命名为pcHis—ibeB 围读码框的正确性 Midi 1．3利用Qiagenrep质粒DNA中量提取试剂盒，分别提取pcD— NA3．】／HisC和pcHis—ibeB质粒DNA 2稳定转染Hela细胞 transfeetion 2．1利用Fugene”’6 reagent，对Hela细胞进行转染，通过lO 一】4天的G418筛选，挑取单克隆，扩大培养，形成能够稳定传代的细胞克 隆株 2：2利用His—tag的抗体，用Westernblot方法检测His6一IbeB融合蛋 白的表达，以此来鉴定转染成功的单克隆细胞株 3观察稳定转染ibeB基因的单克隆Hela细胞株生物学特性的变化 3．i倒置光学显微镜下观察细胞的形态、贴壁状态 3，2利用荧光技术观察细胞的细胞骨架组分一微丝的变化 3．3细胞粘附试验观察细胞在底物上的贴附能力 3．4细胞伸展试验观察细胞的伸展能力 3．5划痕愈合试验观察细胞的运动能力 3．6免疫荧光技术观察细胞的Vinculin的变化 ·2． K1对稳定转染ibeB基因的Hela细胞的侵袭力变化与细 4检测E．coli 胞骨架改变的关系 4，l利用荧光技术观察稳定转染ibeB基因的Hela细胞的细胞骨架微 丝的变化 4．2利用微管蛋白的抗体，通过免疫荧光技术观察ibeB基因的表达对 Hela细胞微管的影响 表达对Hela细胞Nestin的影响 K1对稳定转染ibeB基因的Hela细胞的 4．4细菌侵袭试验分析E．coli 侵袭力变化 5IbeB蛋白的稳定表达影响Hela细胞微丝变化的分子机制研究 5．1重组质粒pEGFPNl一ibeB的构建 coti 5．1．1常规方法提取EK1细菌DNA 5．1．2根据ibeB基因的基因序列，考虑定向克隆的需要，分别设计带有 接头序列的上游引物和下游引物，从￡．coliKI细菌DNA中利用PCR技术 扩增ibeB基因ORF —ibeB 的正确性 5．【．5利用杭州维特洁公司的无内毒素型超纯质粒DNA中量制备i式 剂盒，提取无内毒素型质粒DNA，准备转染 5，2荧光法观察lbeB—GFP融合蛋白的细胞定位 6Transfection 5．2．1瞬时转染，以FuGENE Reagent作为转染试剂 5．2．2荧光显微镜观察活细胞中IbeB—EGFP融合蛋白的表达 5．3利用GSTdown pull Rho家族小分子GTP酶Racl的活性水平 5．4Western blot方法检测Akt／PKB的磷酸化水平 结 果 l成功构建真核表达载体pcHis—ibeB ·3· 为下一步的免疫学检测提供方便。 2得到稳定表达ibeB基因的Hela细胞克隆株 3ibeB基因的外源性表达可以对Hela细胞的生物学特性产生影响 3．1经ibeB基因稳定转染的Hela细胞的形态学变化明显，出现了与 ￡．coti侵袭真核细胞相似的形态学变化，表现为细胞向外周伴晨，形成较明 显的片状伪足(Lamellipodia)，细胞面积变大。