实验动物皮肤病原真菌分子生物学检测方法的建立及应用.pdfVIP

中文摘要 养物，接种于沙氏液体培养基，置27℃恒温摇床80转／分振荡 培养10天。将培养液倒入100ml离心管内离心，沉淀装入1．5ml Ep管中，．70℃或液氮保存。取以上冷冻保存的三种菌沉淀 物少量(各约1 Omg)用破壁酶破壁，使用酚氯仿抽提法抽提 11 11 DNA；然后用皮肤病原真菌通用引物(CHSS，CHSR)和 随机引物(FMl)进行PCR扩增，鉴别三种皮肤真菌标准菌 株。 2通用引物PCR特异性及敏感性测定 特异性测定：用皮肤病原真菌通用引物进行PCR，扩 增大肠杆菌DNA(化学裂解法提取)、犬肝炎病毒DNA及 小鼠肝癌H22细胞DNA(由本室提供)。 敏感性测定：DNA提取方法同上，以紫外分光光度法 O倍系列 测定DNA质量浓度，根据测定值将DNA进行1 质量浓度稀释，得到100ng一10龟的8个质量浓度，然后对 其进行PCR扩增。 3皮肤病原真菌动物模型的建立：取三种标准菌株传种 到沙氏斜面固体培养基，27℃培养1O天。取下菌落加适量灭 菌生理盐水制成菌悬液，用划痕法建立实验动物皮肤病原真 菌动物模型。 4使用分子生物学方法及传统方法检测皮肤病原真菌： 用接种铲从建立的动物模型身上刮取毛发及鳞屑于沙氏斜 面固体培养基上培养，2～3天后菌落长出，从培养基上刮取 菌落提取DNA及用通用引物PCR扩增鉴别，同时将可疑菌落 分离纯化，6～7天后用随机引物FMl进行PCR扩增鉴别，12～14 天后根据镜检及菌落形态鉴别皮肤病原真菌。 5河北省各地实验动物的皮肤病原真菌检测：从实验动 中文摘要 得到大小分别为1 三种标准菌株相比，有明显差异。此菌经过分离纯化培养， 开始为白色菌落形似须毛癣菌，8天后出现灰色菌毛，与三 种标准菌株形态差异显著。鉴定其为皮肤病原真菌，但不 在三种实验动物皮肤病原真菌之列。 结论 11 11 l皮肤病原真菌通用引物(CHSS，CHSR)具有较 强的特异性。将皮肤病原真菌通用引物PCR与AP．PCR技术相 结合，可快速、准确鉴别实验动物皮肤病原真菌。 2实验验证皮肤病原真菌通用引物PCR检测敏感度为 lOO龟。 3通过“划痕法’’，使用经过固体培养基的培养、保藏 和液体培养基的传代的标准菌株，仍能比较容易的制备出皮 肤病原真菌动物模型。 4分子生物学方法与传统方法相比具有快速、敏感、特 异性强的优点，经过进一步验证认为可替代传统的实验动物 皮肤病原真菌检测方法。 关键词：皮肤病原真菌；真菌检测；动物模型；通用引 物PCR；AP．PCR 英文摘要 The and ofthe for Assays DeVelopmentApplication of in theDetection Dermatophytes Pathogenic AnimalswithMolecular Laboratory Biological Method ABSTRACT as objectiVe：Laborato叫animals，suchmouse，rat，guine