应用改良race法钓取栉江珧抗菌肽基因的实验研究.pdfVIP

应用改良RACE法钓取栉江珧抗菌肽基因的实验研究 中文摘要 近几年来的研究表明，抗菌肽是生物在漫长进化历程中保存下来的天然免 疫机制之一，并且已经在海洋软体动物中发现了一些新的抗菌肽家族成员。该家 族是由特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽。在双壳贝类中，贻 贝的抗菌肽研究较为透彻，而其他双壳贝类的抗菌肽研究报道不多；因而其他贝 类抗菌肽是一个有很大研究开发价值的领域。随着许多抗菌肽eDNA成功地克 隆，研究人员正逐渐放弃从低等动物血淋巴直接分离纯化(如酸提、层析等)抗 ， 菌肽的繁琐步骤，转而利用现代分子生物技术结合基因工程方法获得大量的新的 抗菌肽。 目的： 栉江珧抗菌肽基因eDNA快速筛选鉴定方案； 2．运用新的初步筛选方案钓取与双壳贝类抗菌肽基因具有高同源性的基因并克 隆其基因。 方法： 1．总RNA提取及反转录 Reverse Transeriptase试剂盒进行反转录获得eDNA。 2．抗菌肽基因筛选方案一 物，另一个引物与mRNA差异显示法(DDRT-PCR法)简化的锚定引物相同； 2)利用锚定引物和基因特异性引物进行3’eDNA末端快速扩增PCR(3’ RACE)，获得带有双壳贝类抗菌肽eDNA3’端保守序列的扩增产物； 3)扩增产物通过AT克隆法连接至pGEM．TEasy载体中，挑选阳性重组子并 进行DNA序列分析； 源性比较。 3．抗菌肽基因筛选方案二 1)根据Mytilins基因的保守序列设计特异性简并引物，用5’RACE试剂盒进 行eDNA末端快速扩增PCR(5’I淤CE)； 2)扩增获得带有双壳贝类抗菌肽保守序列cDNA的5’端基因片段，经AT克 隆至pGEM-TEasy载体中； 3)挑选阳性重组子，进行DNA序列分析； 源性比较。 结果： 1．通过3’eDNA末端快速扩增法从栉江珧血淋巴总RNA扩增出多个带有双壳贝 类抗菌肽保守序列的3’端基因片段，其长度在800bp以下； 2．AT克隆至--pGEM．TEasy载体中构建重组载体，筛选出阳性重组子及进行DNA 全序列分析得到2个未知基因的3’端碱基序列信息； 3．根据设计的Mytilins基因特异性简并引物，用5’eDNA末端快速扩增法从栉江 珧血淋巴总l玳A扩增出多个带有双壳贝类抗菌肽保守序列未知基因的5’端基因 片段，其长度在800bp以-F； 4．进行AT克隆，筛选出阳性重组子克隆并进行DNA序列分析得到3个未知基因 的5’端碱基序列信息； 5．根据上述两种方法筛选得到的未知基因碱基序列信息与数据库中双壳贝类 抗菌肽eDNA序列进行同源性比较显示与抗菌肽Mytilins基因同源性不高。t 6．由于时间的限制未能进一步进行全长eDNA克隆，获得cE『NA的全部碱基序列 信息。因此，尚无法确定上述获得的带有双壳贝类抗菌肽保守序列的5个未知基 因片段是否为新的抗菌多肽基因。 结论： 利用设计的锚定引物、基因特异性引物和简并引物，运用3’RACE和5’ RACE等多种实验技术方法，在栉江珧钓取出带有双壳贝类抗菌肽保守序列的未 知基因。本实验对初步建立一种全新的双壳贝类抗菌肽基因eDNA快速筛选鉴 定方案提供了一定的实验依据。 关键词：双壳贝类；栉江珧：抗菌肽；基因；RACE；DNA序列分析 3 novel of on antimicrobial Experimentalstudyfishing peptidesgene Atrina RACE pectinatabyimprovedtechnique Abstract Recentresearchesindicatethattheantimicrobialisoneofnatural year peptide immunemechanismswhichremai