RNA纯化技术规程.pdfVIP

中国人类遗传资源 人体组织核糖核酸的提取和纯化 技术规程 Technical Specification for Extraction and Purification of Human Tissue RNA （讨论稿） 中国人类遗传资源平台项目组 2007 年 1 月 前 言 提取核糖核酸的方法很多，但大多是借助于国外的经验。本规则充分考虑了中国的国情， 在遵守分子生物学准则前提下，制定了核糖核酸从多种组织中的提取方法。使提取纯化的核糖 核酸能够有相关国家标准和行业标准，为有效保护和合理利用生物资源，提供一套符合我国实 验室条件的可以遵循的规程。 本规程的编排格式遵从 GB/T 1.1—2000《标准化工作导则 第1 部分：标准的结构和编写 规则》。 II 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 术语和定义 1 3 RNA提取的原理 1 4 RNA提取的步骤和方法 1 4.1 主要的RNA酶污染源及预防 1 4.2 RNA酶的抑制剂 2 4.3 破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法 3 4.4 哺乳动物细胞总RNA的分离 4 4.5 提取步骤 5 4.6 用异硫氰酸胍和有机溶剂提取细胞中RNA 6 4.7 石蜡组织RNA提取方法 7 5 mRNA的分离 9 5.1 分离原理和意义 9 5.2 分离步骤 10 6 RNA提取的注意事项 12 参 考 文 献 13 III 人体组织核糖核酸的提取和纯化技术规程 1 范围 本规程适用于实验室较大批量的提纯分离 RNA并对样本进行长期保存。对实验的原理，方 法和注意事项进行了详尽的描述和讨论。每一个实验室的具体操作可以根据实际情况进行修改。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 核糖核酸 ribonucleic acid，RNA 由脱氧核糖核酸（DNA）为模板转录合成的核糖核酸的片断。 3 RNA 提取的原理 为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了强变性剂如盐酸胍或硫氰酸胍使细胞裂 解，同时溶解和变性内源性的RNA酶。这种用硫氰酸胍提取RNA的方法是首先由Ullrich等简要提 出的。培养好的组织或细胞用硫氰酸胍溶解，所得的匀浆铺在氯化铯浓溶液上。由于RNA在氯化 铯中的浮密度比其他细胞组分的浮密度大得多，在超速离心过程中rRNA和mRNA沉到管底。蛋白 将保留在胍基盐裂解液中而DNA悬浮在氯化铯上层液体中。 4 RNA 提取的步骤和方法 为了获得高质量的真核细胞 mRNA，必须使用 RNA 酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活 RNA 酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的 RNA 酶的活性。同时，避免 偶然引入实验室内其他潜在的痕量 RNA 酶也很重要。下面列举避免 RNA酶污染问题的一些注意 事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一 种或几种方法加以解决。 4.1 主要的RNA 酶污染源及预防 4.1.1 主要的 RNA 酶污染源 如不谨慎操作，外源性 RNA 酶可以通过玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员和溶液等