4学时实验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定.PPT

《生物化学实验》  目 录 实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 实验五 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时 实验六 血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 实验八 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时 实验九 脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时 实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 (操作性) 4学时 实验十一 酪蛋白的制备 (操作性) 4学时 实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定 (综合性) 3学时 实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 实验八 维生素C的定量测定 实验九 脂肪酸的β-氧化 实验十一 酪蛋白的制备 【实验步骤】 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至 40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL，用精密pH试纸或酸度 计调pH至4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化 1.用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。 2.在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转 移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀 【实验试剂与器材】 1、0.5%（m/V）淀粉溶液 2、0.9%（m/V）NaCl溶液 3、0.5mol/L丁酸溶液 4、15%三氯乙酸溶液 5、10%氢氧化钠溶液 6、10%盐酸溶液 7、0.1mol/L碘溶液 8、标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液 9、1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲液 10、恒温水浴 11、微量滴定装置 12、解剖用具 13、玻璃器皿 【实验步骤】 1、肝糜制备 （1）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用0.9%NaCl溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。 （2）称取肝组织5g置研钵中，加少量0.9%NaCl溶液，研磨成细浆。再加0.9%NaCl溶液至总体积10ml，得肝组织糜。 2、酮体生成和沉淀蛋白质 取50ml锥形瓶2只，编号，并按下表操作。 混匀，静置15min，过滤，滤液分别收集于2支试管中 2 - V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml 3 3 V(15%三氯乙酸溶液)/ml 混匀，置于43℃恒温水浴内保温1.5h 2 2 V(肝组织糜)/ml - 2 V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml 3 3 V(1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲液)/ml 2号（对照） 1号（样品） 锥 形 瓶 编 号 试 剂 混匀后立即用0.01mol/L标准的硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定A瓶与B瓶溶液所用硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮含量。 4、计算 肝脏的丙酮含量（mmol/g）=（V对照-V样品）×CNa2S2O3÷6 式中：V对照为滴定对照所消耗的标准Na2S2O3溶液的体积，以ml为单位； V样品为滴定对样品消耗的标准Na2S2O3溶液的体积，以ml为单位； CNa2S2O3为标准Na2S2O3溶液的浓度（mol/L）。 【注意事项】 1、用新鲜肝糜进行实验，确保肝内酶活力。 2、注意滴定终点的控制，保证实验的准确度。 【思考题】 1、为什么说脂肪酸β-氧化实验的关键是制备新鲜的肝糜? 2、什么叫酮体?为什么正常代谢时产生的酮体量很少? 实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 【实验目的】 学习和掌握琼脂糖凝胶电泳法分离乳酸脱氢酶同工酶的原理和方法。 【实验原理】 能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶。同工酶的蛋白结构既有差别，它们的理化性质也就有所差异，因此可用电泳或其他方法将它们分离开来。 本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱 氢酶5个同工酶（LDH1、 LDH2 、 LDH3、 LDH4 和LDH5 ）。 【实验试剂与器材】 1、巴比妥—HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol/L） 2、0.5mol/L乳酸钠溶液 3、0.001mol/L EDTA·Na2溶液 4、0.5%琼脂糖凝胶 5、0.8%~0.9%琼脂糖染色胶 6