细胞信号通路检测（二）.pptVIP

为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。 一抗的选择 ： 确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。 抗体选择： 单克隆抗体 或者 多克隆抗体 直接标记的抗体 或者 未标记的抗体 抗体的实验目的：对不同实验选用不同抗体 WB（免疫印迹）、IHC（免疫组化）、ELISA（酶联免疫反应）、FC（流式细胞检测）、 IP（免疫沉淀） 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数. 步骤六、抗体孵育 * 二抗的选择： 抗小鼠 抗兔 抗大鼠 抗人 抗山羊 抗鸡 抗豚鼠 抗马 根据一抗物种： 根据标记物： 标记物 HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记 一抗、二抗孵育 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 * 化学发光法： 常用HRP酶标系统的显色底物为ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。 化学显色法： 常用酶标系统HRP的显色底物为TMB和DAB 酶标系统AP的显色底物为BCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。 二抗与底物反应显色 * Step4 转膜 Step6 免疫反应 Step7 显色或发光 Step2 蛋白定量 Step3 SDSStep1 蛋白样品制备 Step5 封闭 Perfect Data 根据实验结果判断相关信号通路活化情况，并作出讨论 细胞信号通路检测（二）Western Blot * 病理生理学教研室 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 * Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相 载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 Western Blot 应用： 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究 * Step4 转膜 Step6 免疫反应 Step7 显色或发光 Step2 蛋白定量 Step3 SDSStep1 蛋白提取 Step5 封闭 总蛋白抽提程序： ?PBS冲洗细胞(我们采用的细胞是E0771)3次（此步骤我们省略） 加入裂解缓冲液（RIPA其中我们已加入PMSF）80ul（1.5*106个细胞大约加入100ul裂解液，或100ml培养皿中加入100ul裂解液），冰上放置20-30min 收集裂解液到EP管中 4度离心，12000转/分，2-10min 吸取上清，蛋白定量（实验条件所限我们不做），分装（也不做，直接用总体积上清即80ul与5X上样缓冲液20ul混合），加入5X上样缓冲液20ul，煮沸5-10min，保存在-80度备用。 聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N’-亚甲基双丙烯酰