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DNA重组技术的基本工具 1。基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。 2.DNA重组技术的基本工具 ①、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切酶 A、作用——限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 B、限制性内切酶的切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，SmaI识别CCCGGG序列: 他们识别的核苷酸序列不同,但是切点都是在G↓C之间。 C比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。 （4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 ②.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。 ③.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的分类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体使用的目的：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制 ②有多个限制性内切酶切点 ③有一定的标志基因，便于筛选 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 一基因的结构： 基因是有遗传效应的DNA片段(注：RNA病毒为RNA)，分为编码区和非编码区。 编码区：能转录出mRNA，原核生物中也就是能编码蛋白质的区段 非编码区：不能转录出mRNA，也不能编码蛋白质的区段 （１）原核细胞基因的结构 非编码区中存在调控遗传信息表达的核苷酸序列: ①编码区上游的RNA聚合酶结合位点，即启动子，可控制RNA聚合酶的结合。RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并结合调控序列中的结合位点，能催化DNA转录为RNA ②编码区下游有终止子，可控制RNA聚合酶的停止、脱落。 （2）真核细胞基因的结构 二 基因工程的基本操作程序 1。目的基因的获取： A目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。 B获得目的基因的方法 （1）从基因文库中获取目的基因： 基本概念的理解： ①将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 ②将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后将这些片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因。这种基因文库叫基因组文库。 ③有些基因文库比较小，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库（用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。） 怎样提取： 根据目的基因有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体的位置，基因的转录产物mRNA以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 ⑵利用PCR技术扩增目的基因： 原理：DNA双链复制的基本原理 前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。 条件：a..四种脱氧核苷酸 b.DNA的两条链为模板 c.热稳定DNA聚合酶(Taq酶） d.一对引物（一小段单链DNA或RNA，一般20～30个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对） e.温度控制和缓冲液 PCR技术扩