CRISPR敲基因的新技术.ppt

CRISPR/Cas9 What is CRISPR ？ 【CRISPR】clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat。 成簇规律间隔短回文重复。 是一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑工具。 CRISPR/Cas9系统的发现 CRISPR/Cas系统最早是在细菌的天然免疫系统内发现的，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大学（OsakaUniversity）的研究人员在E.coliK12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR），目前普遍认为有40%的细菌基因组具有这样的结构。 CRISPR/Cas9系统的组成 .CRISPR/Cas9系统由CRISPR序列元件与Cas基因家族组成。其中CRISPR由一系列高度保守的重复序列（repeat）与同样高度保守的间隔序列（spacer）相间排列组成。而在CRISPR附近区域还存在着一部分高度保守的CRISPR相关基因（CRISPR-associated gene, Cas gene）这些基因编码的蛋白具有核酸酶活性的功能域，可以对DNA序列进行特异性的切割。 CRISPR/Cas9系统元件与特征 CRISPR的结构（以嗜热链球菌LMD-9基因组CRISPR1/Cas系统的位点为例）。蓝色表示Cas基因，包括广泛存在的cas1和cas2，II类系统特征基因cas9和csn2。黑色表示重复间隔物序列（CRISPR）。黑色菱形表示CRISPR的重复序列（repeat）灰色长方形表示间隔物序列（spacer）。缩写：L，前端；T，末端； CRISPR/Cas9系统工作原理 CRISPR/Cas作为原核生物中普遍存在的一种系统，最初的功能就是识别外源性入侵的核酸序列，并对其进行特异性降解，以达到抗病毒的作用。这一过程分两步进行——crRNA的合成及在crRNA引导下的RNA结合与剪切，包含crRNA的生物学合成和RNA的结合与剪切两大步骤。 CRISPR/Cas9系统工作原理 step 1 CRISPR区域第一个重复序列上游有一段CRISPR的前导序列（Leader sequence），该序列作为启动子来启动后续CRISPR序列的转录，转录生成的RNA被命名为CRISPRRNA（简称crRNA）。 step 2 CRISPR/Cas系统中crRNA与tracrRNA（反式激活的crRNA）形成嵌合RNA分子，即单向导RNA（Single guide RNA,sgRNA）。sgRNA可以介导Cas9蛋白在特定序列处进行切割，形成DNA双链断裂（Double-Stranded Break, DSB），从而完成基因定向剪切编辑等各类操作。 CRISPR/Cas9系统的分类 CRISPR/Cas系统可以分为I类系统、II类系统和III类系统。这三类系统又可以根据其编码Cas蛋白的基因不同而分为更多的亚类。不同类型CRISPR/Cas系统完成干扰的步骤也有所不同。 CRISPR/Cas9系统的分类 CRISPR/Cas9系统的分类 在I类系统中，入侵的DNA有Cascade:crRNA复合体识别，PAM模块则能促进外源性DNA的识别，随后核酸酶Cas3被募集并将目标DNA降解。在II类系统中，只需要单独的Cas9蛋白即可完成干扰，并不依赖一个多蛋白复合体，Cas9和反式激活的crRNA（tracrRNA）、前crRNA（pre-crRNA）形成复合体，该复合体促使RNA酶III将前crRNA加工为成熟的crRNA。在III类系统中，一个多蛋白复合体（Csm或Cmr）或Cas6促进前crRNA转化为成熟的crRNA，最终导致目标DNA的降解 II类CRISPR/Cas9系统 它是利用一段小向导RNA（sgRNA）Cas9复合体系统靶向基因组编辑的步骤。将编码密码子优化的Cas9（红色）序列、一段核定位序列（NLS）和一段包括目标靶序列的小向导RNA（sgRNA，黄色）序列同时构建在一个质粒中，再将质粒转染进目标细胞。一个有功能的sgRNA:Cas9干扰复合体会在细胞内完成组装，该复合体会在PAM结构的上游目标DNA序列上诱导产生一个双链断裂（DSB），而DSB则能被宿主细胞的DNA修复系统、同源重组系统（HR）和非同源末端连接途径（NHEJ）修复。HR系统以宿主的等位基因为模板复原野生型序列，将序列恢复为断裂前的状态；而容易出错的NH