蛋白质工程制药1.pptVIP

蛋白质工程制药 主要内容 第一节 概述 第二节 蛋白质的分子改造 第三节 蛋白质工程在制药中的应用 概述 蛋白质工程，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。 蛋白质工程制药是蛋白质工程在制药方面的应用。 蛋白质工程程序 蛋白类药物的种类 一 蛋白质工程的研究内容： 1 利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。 2 定量确定蛋白质结构-功能关系。这是目前蛋白质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等. 3 从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋白质。 4 根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体. 二 ??蛋白质工程的基本步骤 1 分离纯化目的蛋白，使之结晶,进行分析,得到其空间结构的尽可能多的信息。 2 对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。 3 通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。? 4围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。? ? 5对经过改造的蛋白质进行功能性测定. 3、应注意保留潜在的N糖基化位点(Asn-X-Ser／Thr-X-Pro)中的Asn(天门冬酰胺)、Set(丝氨酸)或Thr(苏氨酸)。 4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。?? 5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。 6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。 7、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。 一、?初级改造?? 通过基因突变方法，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。? 目前，主要采用的基因突变方法： 基因定位突变 盒式突变。 基因定位突变 根据三联体密码，编码DNA（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。 这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 基因定位突变的基本过程： 首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统(如大肠杆菌等)即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。 过程： 将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特定的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变； 两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引物是互补的。由于两个反应中引物的位置不同，所以PCR扩增后，产物有不同的末端。 将两管PCR产物混合、变性、复性，则每条链会与另一管中的互补链退火，形成有两个切口的环状DNA，转入大肠杆菌后，这两个切口均可被修复。若同一管子中的两条DNA链结合，会形成线性DNA分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在，只有环状DNA才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。 盒式突变是定点突变的一种方式。即在某一氨基酸位点进行“饱和性”突变。系在合成寡核苷酸到某目的改变的氨基酸时，反应系统中同时加入4种dNTP，以期出现每一种密码。将这混合的寡核苷酸引入克隆，并转化宿主，则可能获得在目的位点有各种氨基酸的突变株，有利于研究不同氨基酸对蛋白质的结构和功能的影响。 药物设计的改造 作为改变糖尿病患者命运的重要发现,胰岛素是糖尿病治疗中不可或缺的药物。传统胰岛素基本上都有见效慢、药效过长等问题。也就是说,患者需要在就餐前提早较长的时间注射胰岛素;而当其血糖降低到适度情况下之后,胰岛素的降糖效果可能会持续作用,容易导致低血糖的出现。胰岛素类似物的研发,能更好地模拟正常人体生理降糖模式,使糖尿病患者最大程度获益。?　　胰岛素类似物是采用基因工程技术,经过修饰人胰岛素分子的氨基酸序列而成的。 一、速效胰岛素类似物:?　　临床上主要的速效胰岛素类似物产品有赖脯胰岛