猪脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体的制备与鉴定.pdfVIP

猪脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 摘要 将猪脂肪用胶原酶lI消化，离心后获得猪脂肪细胞。加入细胞膜萃取液， 用超声波细胞粉碎机粉碎，离心后获得三酰甘油酯：经蔗糖密度梯度离心法 提取猪脂肪细胞膜蛋白。用该脂肪细胞膜蛋白作抗原，加弗氏佐剂后免疫 BALB／c小鼠，免疫剂量分别为100ug／鼠、1 00ug／鼠、50ug／鼠，经抗体效价 测定，取明显高于阳性血清的免疫小鼠进行加强免疫，用其脾细胞与骨髓瘤 细胞SP2／0在融合剂聚乙二醇(PEG，MW4000)作用下融合，经有限稀释法克 隆和亚克隆，建立了2株能持续分泌抗猪脂肪细胞膜单克隆抗体的杂交瘤细 胞株382和3F3。对得到的杂交瘤细胞株经腹水效价测定、染色体数目分析、 对热及酸、碱稳定性的测定、免疫球蛋白类别及亚类鉴定、特异性及亲聋口力 的测定方法进行鉴定。 结果表明：所获猪脂肪细胞膜蛋白抗原的浓度为4．97mg／ml，对该蛋白 6．0KD一66．2KD之间存在两个条 进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，得出：在11 带，在66．2KD一45．0KD之间存在两个条带，在14．4KD以下存在一个条带，其 中存在64KD的猪特异性脂肪细胞膜蛋白；对免疫小鼠抗体效价进行测定，其 中有三只小鼠抗体效价明显高于阳性血清：通过猪脂肪细胞膜蛋白单克隆抗 体的制备，得到2株能持续分泌抗猪脂肪细胞膜单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 5，鉴定 命名为382和3F3；对所获单抗用ELISA法测其腹水效价，为1：10 其亚类类型为IgGl和IgG2b，染色体数目为80～100条，竞争抑制率在50％ 以上，ELISA法测定它与猪脂肪细胞膜蛋白抗原的亲和常数为4．63X109，并 且所分泌的单抗对热、酸、碱等环境因素基本保持稳定。 关键词：猪脂肪细胞膜蛋白 杂交瘤细胞单克隆抗体 文献综述 …脂肪细胞膜免疫调控体脂的研究进展 !追着畜牧养殖业的迅速发展，肉、蛋、奶在市场中得到极大丰富，人类 膳食结构中肉类比例逐年提高。1998年，我国肉类产量占世界2．12亿吨的 1／4，排位第一．其中猪肉达4327万吨，占世界总量的一半“3，2000年中国 人均肉类达52公斤。1。与此同时，世界范围内大量流行病学资料和临床资料 显示：过多动物性脂肪的摄入与肥胖、超重、糖尿病、高血脂等所谓“文明 病”的发生与发展密切相关，特别是动脉粥样硬化及冠心病被认为与膳食中 富台饱和脂肪和胆吲醇有关，因此，美国“国家胆固醇教育计划”推荐，脂 肪提供的能量应低于总能量的30％，饱和脂肪提供的热量应低于总能量的 lo％，而胆蛔醇的摄入每天不能超过30m901。随着我国人民生活水平的提高， 消费者在对食物的选择上，不但强调营养成分的含量，而且更关注营养成分 多寡列健康的影响，特别是对于动物性食品的选择越来越倾向于低脂(主要 是饱乖口脂肪酸)高蛋白的肉制品。为了满足消费者的需求，降低动物体脂， 提高肉品品质已成为多年来研究的热点。 国内外科技工作者对如何控制畜禽脂肪代谢，降低动物体脂、肝脂，提 高瘦肉誊和肉品质等方面做了大量的工作，但出于脂肪代谢机理复杂，受多 种因素影If虮没有统一的定论“。。近几年来，本课题组从中草药、代谢性修 饰剂及免疫学调控三个方面对脂肪代谢进行了研究，并取得了一定成果。“1， 但因前两者都是外源性的，有一定的局限性，因此目前的研究主要集中于免 溲字：j嚣蛋白酯酶和脂肪细胞膜免疫)方面。 】脂肪细胞膜(APM)免疫 lh。itJ细胞黢免疫调控动物体脂含量的研究，国外研究的较多，而国内仅 见本课题组及赵伟“’“列猿和大鼠的研究，其余只是偶见综述性报道。6。“。 1．1脂肪细胞膜免疫的分类 脂肪细胞膜免疫可以分为主动免疫和被动免疫两种，被动免疫又有多克 隆抗体免疫、单克隆抗体免疫和重组DNA抗体免疫几种途径。 1．1．1脂肪细胞膜主动免疫 脂肪细胞膜主动免疫是直接以脂肪细胞膜为免疫原，引起动物对脂肪组 membrane， 织产生主动的