核酸分子杂交 - Sojubio.PDF

核酸分子杂交 核酸杂交（Nucleicacidhybridization），又称核酸分子杂交。 原理：是核酸变性和复性理论。双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开形成单链， 当理化因素消除后，具一定同源性的两条 （探针和待测核苷酸序列）单链在适宜的温度及离 子强度条件下，可按碱基互补配对原则特异性地复性形成双链。核酸分子杂交可在DNA与 DNA、RNA与RNA或RNA与DNA 的二条单链之间进行。 分类：核酸分子杂交按作用环境不同分为固相核酸分子杂交和液相核酸分子杂交。 一、固相核酸分子杂交 原理：将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物 有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段 很容易漂洗除去，膜上的杂交物容易检测并能防止靶DNA 自我复性，故该方法最为常用。 常用类型：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southernblot杂交、Northernblot杂交、 组织原位杂交和夹心杂交等。 基本操作步骤： 1、制备样品：从待检测组织样品中提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产 生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。再将含有DN*** 段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样检测片段在凝胶上的 位置就直接反映在了转印膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交 联固定。 2、制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可 以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这 样，通过检测与转印膜上的核酸分子结合的探针分子，就可知道被检测的核酸片段在膜上的 位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。 3、杂交：在杂交前先进行预杂交，封闭膜上非特异的DNA结合位点，以降低非特异性杂 交。正式杂交时，由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以核酸杂交过程中只需 变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。 4、检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要放射自显影 来检测核酸片段在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应 的免疫组织化学的方法进行检测。 二、液相核酸分子杂交 液相核酸分子杂交，是一种研究最早且操作复杂的核酸杂交类型，在过去的30年里虽被应 用，但总不如固相杂交那样普遍，主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困 难，误差也较高。 常用的两种固相核酸分子杂交技术 1.SouthernBlot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离， 继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素 或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列， 则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检 测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 2.NorthernBlot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相 同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 常见问题 Q1：标记方法有哪几种？ A1：（1）切口平移法 （2）随机引物法 （3）末端标记法 （4）单链DNA探针标记 （5）寡核 苷酸探针标记法 Q2：探针标记物的分类有几种？ A2：（1）探针标记物有放射性核素与非放射性物质两种。放射性核素标记敏感性高，可检 测pg水平的核酸，但因不易长期保存，且存在放射性污染等问题，现已较少应用。 （2）非放射性物质常用的有生物素、地高辛等，非放射性探针安全、稳定、操作方便并 且经济，但敏感性较低，近年来，由于杂交信号检测方法的改进，检测的敏感性得到了很大 提高。 Q3：怎样确定探针的浓度？ A3：总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增 加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜核酸分子杂交中放射性核素标记探针与非放射 性标记探针的用量分别为5-10ng/ml和25-1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记 探针，其用量均为0.5-5.0 μg/ml。 Q4：如何选择核酸分子杂