演示课件节选版本-激光共聚焦显微术.pptVIP

激光共聚焦显微术及其在纳米生物科学中的应用 复旦大学分析测试中心 任庆广 2010.6 Outline 一、显微镜发明历史回顾 光学显微镜成像历史、常用概念 二、激光共聚焦显微术原理： （传统光学成像原理VS 共聚焦成像原理 光切、三维成像、荧光强度、光谱分析） 三、激光共聚焦显微术在纳米生物学研究中的应用 热点之一：量子点（CdSe、CdTe） 热点之二：硅壳纳米荧光颗粒 热点之三：ZnO纳米颗粒 四、双光子激光共聚焦显微镜 分辨率极限 在接下来的两个世纪中，复合式显微镜得到了充分的完善，例如人们发明了能够消除色差（当不同波长的光线通过透镜的时候，它们折射的方向略有不同，这导致了成像质量的下降）和其他光学误差的透镜组。 与19世纪的显微镜相比，现在我们使用的普通光学显微镜基本上没有什么改进。原因很简单：光学显微镜已经达到了分辨率的极限。 ? 如果仅仅在纸上画图，你自然能够“制造”出任意放大倍数的显微镜。但是光的波动性将毁掉你完美的发明。即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射——简单的说，物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，你就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高也无济于事了。 对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。 ? 提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。 K?hler Illumination 一、什么是柯勒照明？ 　1893年德国蔡司的科勒先生(August Kohler) 首先研发了一种完善的照明方法, 而成为一种能对样品提供最佳照明的方。随后，由于这一方法能使样品获得均匀而又充份明亮的照明，而且又不会产生耀眼的眩光。 因此，近代的实验室用显微镜制造厂都纷纷推荐使用这一方法， 从而使得显微镜的使用人员可以发掘出显微镜的所有潜在能力。 　  二、科勒照明的好处？ 1. 灯丝不落在被检物平面上，照明均匀； 2. 照明的热焦点不在被检物，不会灼伤被检物； 3. 聚光镜将视场光阑成像在被检物平面处，改变大小可控制照明范围。 Properties of Light Ocular Objectives Condenser Numerical Aperture Refractive Index Aberrations Optical Filters Numerical Aperture For a narrow light beam (i.e. closed illumination aperture diaphragm) the finest resolution is (at the brightest point of the visible spectrum i.e. 530 nm)…(closed condenser). Object Resolution Example: 40 x 1.3 N.A. objective at 530 nm light Numerical Aperture For a narrow light beam (i.e. closed illumination aperture diaphragm) the finest resolution is (at the brightest point of the visible spectrum i.e. 530 nm)…(closed condenser). Object Resolution Example: 40 x 1.3 N.A. objective at 530 nm light Fluorescence Microscopes Cannot view fluorescence emission in a single optical plane Generally use light sources of much lower flux than confocal systems Are cheaper than confocal systems Give high quality photographic images (actual photographs) whereas confocal systems are restricted to small resolution ima