检测鸡痘病毒抗体间接ELISA方法的建立.pdfVIP

HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicine № 12 2012 检潮鸡痘病毒抗体闻按 ELISA方法的建立 纪朋艳 ，卢广林 (1．吉林医药学院实验中心，吉林 吉林 132013；2．吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101) 中图分类号：$852．659．1 文献标识码：B 文章编号：1004—7034(2012)12—0094—02 鸡痘是由鸡痘病毒 (FPV)引起的鸡的一种接触 3次(每次5min)，将阳性血清分别以 1：50、1：100、 性传染病，可引起鸡只大批死亡，尤其对雏鸡造成的 1：200、1：400倍比稀释，100 L／孔，37℃作用2h后进 损更严重失，使用疫苗进行免疫预防是控制本病的重 行方阵试验；再用 PBsT洗 3次(每次5min)，每孔加 要措施 。 1：10000稀释的酶标抗体，100 L／孔，37℃作用2h； 检测鸡血清中鸡痘抗体，可以了解疫苗免疫状况 用PBST洗 3次，每次 5min；加入 OPD底物溶液 和机体感染情况。试验采用ELISA方法检测鸡痘病 100 L／孔，37℃作用 10min；每孔加人 2molfL 毒抗体，并对试验条件进行优化，现报道如下。 HsO50 ，终止反应后用酶标仪测定 OD4帅值，每 1 材料和方法 个稀释度重复 1次，取其平均值。 1．1 病毒和血清 1．4．2 待检血清作用时间的选择 酶标板按选择的 FPV282E4株、鸡痘阳性血清，华南农业大学兽 条件包被、封闭后，加入待检血清，37℃分别作用 医实验室赠送；阴性血清 (1日龄 SPF鸡血清)、待检 0．5，1，1．5，2h，其他步骤同1．4．1。 血清，吉林农业科技学院兽医实验室制备；新城疫、禽 1．4．3 酶标抗体工作浓度的选择 待检血清按 流感阳性血清，华南农业大学兽医实验室提供。 1．4．2确定的时间作用后，将酶标抗体进行1：10000、 1．2 其他试剂 1：15000和 1：20000稀释，100 L／孔，其他步骤同 邻苯二胺 (OPD)、羊抗鸡 IgG—HRP标记抗体， 1．4．2。 Sigma公司产品；犊牛血清、96孔酶标板、SPF鸡胚， 1．4．4 酶标抗体作用时间的选择 将酶标抗体按确 购 自山东省农业科学院家禽研究所；其他化学试剂为 定好的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用O．5， 国产分析纯。 1，1．5，2h，其他步骤同1．4．3。 1．3 抗原的扩增及提纯 1．4．5 底物最佳显色时间的选择 酶标抗体作用、 取9—10日龄SPF鸡胚按常规方法制作鸡胚纤 洗涤、加入底物后，37℃分别作用5，10，15rain，每孔 维细胞 (CEF)，长成单层后接种 FPV，病变达80％以 加入2mol／L的H2SO50 L，终止反应后读数。 上时收获细胞；4℃、2000r／min离心20min；将沉淀 1．5 特异性试验 重悬于PBS中，超声波 (功率为60w)裂解 8个循 分别取新城疫、禽流感和鸡痘阳性血清各 10份， 环，每次 15S；冰浴 45s；36％蔗糖垫底，4cI=、 1：100稀释，用间接ELISA检测，同时设立阴性、阳性 15000r／rain离心 120min；沉淀经超声波再次裂解4 血清对照，观察各血清与系统是否有交叉反应。分别 个循