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3.3 间接法原位PCR 特点：PCR体系中dNTP和引物均不标记 PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交 标记物：以生物素、地高辛较为常用 操作程序： 组织细胞制备：固定、预处理 渗入和原位扩增：dNTP，引物, Taq DNA聚合酶 扩增产物检测：ICC 原位杂交： 用特异性标记探针 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 评价：目前最常用 优点：扩增效率高 特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增 产物中的非靶序列结合） 可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：操作复杂 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 举例：石蜡切片，Dig标记 标本制备：10%福马林固定，石 蜡切片5 ?m。 预处理： ①脱蜡至水; ②0.2mol/L HCl，10’; ③5 ?g/ml 蛋白酶K 37℃ 10’; ④RNase消化37℃ 30’; ⑤Alc脱水干燥。 原位扩增： ①PCR扩增反应液30 ?l，加盖片封边; ②PCR热循环：94℃ 1’，55 ℃ 1’， 72℃ 1.5’， 25-30个循环， 72℃延伸 10’； ③去盖片，4%多聚甲醛后固定10’； ④ Alc脱水干燥。 原位杂交： ①Dig标记探针，98 ℃变性10’，-20 ℃退火5’，42 ℃杂交过夜； ②洗涤：2×SSC 10’ ×3，1×SSC 10’ ×3，缓冲液洗10’ ×3； ③AKP-Dig-Ab，37 ℃，2h; ④BCIP/NBT显色； ⑤脱水、透明、封固。 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.4 原位RT-PCR 原理： 逆转录酶 mRNA为模板 cDNA Taq聚合酶 cDNA为模板 扩增产物 直接（直接法）或原位杂交（间接法）检测扩增产物 注意： 标本先以DNase处理过夜，破坏DNA 反转录条件42℃,30’-60’ 反转录后加热90℃以上灭活逆转录酶 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 程序： 组织细胞制备：10%福马林固定。 预处理：DNase消化过夜；蛋白酶K消化（54℃,20’）；95℃,3’灭活蛋白酶K。 逆转录反应：反应液含逆转录酶、引物、dNTPs，并有RNase抑制剂,42℃,30’-60’。 95℃10’灭活逆转录酶。 PCR扩增：加Taq聚合酶、引物、dNTPs扩增；扩增后烤80℃, 15’-30’。 原位杂交：原位杂交后或直接用ICC检测扩增产物。 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 形态学研究及其 方 法 进 展 宋天保 2006年10月 形态学研究思路和方法 免疫组化方法进展 基于PCR的原位检测技术 1. 形态学研究思路和方法 1.1 形态学发展简史 解剖学的发展 Galen(130 - 200) 《论解剖过程》,《论身体各部器官的功能》 Vesalius(1514 - 1564) 《人体的构造》(1543) 光学显微镜的发明 Leeuwenhoek(1632-1723) Hooke(1635-1702) 《显微图谱》（1665） 1. 形态学研究思路和方法 细胞学说的建立和完善 Schleiden(1804-1881) “植物发生论”（1838） Schwann(1810-1882) “关于动植物的结构和生长一致性的显微研究” (1839) Virchow(1821-1902) 《细胞病理学》(1858) “omnis cellula e cellula” 1. 形态学研究思路和方法 1. 形态学研究思路和方法 电子显微镜的发明和超微结构研究 Knoll和Ruska(1932) Nobelprize1986 1. 形态学研究思路和方法 现代形态学的发展 细胞(组织)化学,免疫细胞化学,原位分子杂交,细胞培养等 向定量化、自动化和数字化发展 1. 形态学研究思路和方法 1.2 形态学的作用和地位 (1)探索生命活动的结构基础 (2)为某些学说的建立提供形态基础 如:神经元学说,肌丝滑动学说 (3)在生命科学研究中的地位逐渐上升 (4)与机能学研究相辅相成 Nobelprize 1906 1. 形态学研究思路和方法 1.3 形态学研究的思路 (1) 水平： 大体观测(器官)—立体显微镜(组织)--光镜(细 胞)—电镜(亚细胞)--扫描探针显微镜(分子和原 子) (2)对象：活体—离体培养 —固定组织 (3)