磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展论文.docVIP

　　磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展论文 【摘要】 蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰，在细胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研究的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低, 难以用质谱直接检测。为了解决这个问题，改善质谱对磷酸肽的信号响应, 需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展，包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和富集法、化学修饰法、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法。 【关键词】 磷酸化蛋白质组，分离富集方法，评述 1 引 言 磷酸化是蛋白质翻译后修饰最为重要的形式。据统计, 哺乳动物细胞内的蛋白质有1/3以上可以被磷酸化。 真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸1。其中，磷酸化丝氨酸最多,磷酸化苏氨酸次之，而磷酸化酪氨酸最少, 三者的比例是1800∶200∶1。最新实验鉴定到三者在真核细胞的百分比为86.4%、11.8%和1.8%2。磷酸化蛋白在细胞信号转导、细胞的分化、增值、周期调控、新陈代谢、转录和翻译、蛋白降解和细胞生存等3方面发挥着重要的作用。 磷酸化蛋白在细胞生命活动中的重要作用.freelan 测序等方法，鉴定磷酸化氨基酸类型及位点4,5 。这种方法除了具有放射性实验的缺点以外，实验比较耗时并且不能进行高通量的磷酸化蛋白组学分析。近年来, 一些富集方法不断改进及涌现，如抗体法、固相金属离子亲和色谱(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱(Metal oxide/hydroxide affinity chromatography, MOAC)、离子交换和等电聚焦、β消除Michael加成反应等。目前各种富集方法与质谱(Mass spectrometry, MS) 技术的结合已成为研究蛋白质磷酸化的主要工具，逐渐取代了传统的磷酸化蛋白质分析方法。本文综述了近年来用于分离富集磷酸化蛋白和肽段的各种方法。 2 磷酸化蛋白分离富集方法 2.1 抗体富集法 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀,.freelacher等7利用两种不同的磷酸化酪氨酸抗体对肿瘤细胞系SUDHL1裂解液分别经免疫沉淀和免疫亲和层析富集磷酸化酪氨酸蛋白，经质谱鉴定表明双抗免疫沉淀法可鉴定到更多的磷酸化蛋白。Pandey等8用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀表皮生长因子(EGF)刺激后的 HeLa 细胞总蛋白质和未刺激的 HeLa 细胞总蛋白质，通过MS分析共鉴定出7个已知的 EGF 激酶底物和1个新的 EGF激酶底物Vav2。Chong等9也利用磷酸化酪氨酸抗体富集鉴定到3个新的EGF信号通路下游的靶蛋白，并且通过该方法还可对蛋白质相互作用进行研究。Gronborg等10对多种商品化的抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体的免疫沉淀性能进行了评价，发现有3个抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体可应用于免疫沉淀，并成功富集了磷酸酶抑制剂 Calyculin A诱导的 HeLa细胞磷酸化蛋白质。 2.2 激酶特异富集法 很多激酶不仅以相互协同的形式动态调控着信号通路，而且还通过特异位点磷酸化来调控自身以及不同激酶间的功能活性11。但是由于激酶相对于其底物来说丰度更低，因此在已有的磷酸化蛋白质组学研究中对于激酶的磷酸化位点的研究尤为不足。免疫沉淀技术可以用于大规模的磷酸化蛋白质组学研究，磷酸化酪氨酸蛋白特异性抗体可以用于磷酸化激酶的富集，但是这些方法不能对激酶进行特异性富集。为了对激酶磷酸化状态进行研究，利用小分子的磷酸激酶抑制剂对其进行特异亲和层析成为激酶磷酸化蛋白质组学研究的重要方法12。另外激酶抑制剂与激酶结合蛋白共同富集显著提高了激酶磷酸化蛋白质组学鉴定水平13。Godl等14首先利用激酶特异富集法对p38 激酶的抑制剂SB 203580的作用底物进行研究，他们利用螯合反应固定了SB 203580的亲和柱富集鉴定的几个未知的激酶底物，并且研究认为： SB 203580对RICK Riplike interacting caspaselike apoptosisregulatory protein (CLARP) kinase/Rip2/CARDIAK抑制作用更加灵敏。 Daub等15利用激酶抑制剂亲和层析法对周期阻滞到S和M期的HeLa S3细胞系进行了定性及定量研究，他们采用同位素标记的固定培养技术对细胞进行培养。细胞裂解后利用5种不同的激酶抑制剂螯合的3个层析柱进