神经节苷脂对PC┐12细胞的抗凋亡作用论文.docVIP

　　神经节苷脂对PC┐12细胞的抗凋亡作用论文 .freeline，DA）神经元的细胞凋亡模型，应用透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪及免疫组化等技术，观察GM1对凋亡中的PC12细胞的影响. 结果 24h后空白对照组凋亡率为2.5%，200μmol L-1 L-dopa处理组的凋亡率为61.6%;100，50和10μmol L-1 的GM1各加200μmol L-1 L-dopa处理组24h的凋亡率分别为29.7%，52.3%.freelechanism of the protection effect of the ganglioside GM1in the treatment of Parkinson’s disease.METHODS 1-treated group at the ranges of100，50and10μmol L-1 apoptosis，and the mecha-nism might be the protection of the cellular membrane. 0 引言 帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的中枢神经系统变性疾病，其特征性病理改变是黑质多巴胺能神经元进行性死亡，导致正常运动消失，出现运动迟缓或震颤.传统的治疗方法是口服左旋多巴（L-dopa）等药物或外科手术［1］ .药物治疗后期疗效下降，其原因与L-dopa对多巴胺能细胞的毒性有关.而神经节苷脂（ganglioside GM1）是存在于哺乳类动物神经组织中的一种重要的神经节苷脂，其活性成分是单唾液酸四己糖神经节苷脂.它具有促进神经生长的作用，对损伤后的神经组织有营养和修复等功能.临床上应用GM1治疗周围神经损伤、脊髓损伤和中风等，甚至有学者［2］ 将其试用于AD的治疗.本实验即是在此基础上，研究GM1抗L-dopa诱导的凋亡作用，探讨GM1可能的抗凋亡机制，为GM1应用于PD的治疗提供相应的理论依据. 1 材料和方法 1.1 材料 流式细胞仪（美国Coulter公司），JEM-2000EX型透射电镜（日本JEOL公司），L-dopa，GM1，胰蛋白酶（美国Sigma生物制品公司），RPMI1640，胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），SABC免疫组化试剂盒、Bcl-2抗体、Bax抗体等试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养及药物处理 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞由中国科学院上海细胞生物研究所提供，置于850g L-1 RPMI1640培养液中，内含100mL L-1 胎牛血清，谷胺酰胺2mmol L-1 ，青霉素5×104 U L-1 ，链霉素25mg L-1 ，培养瓶中预先铺以0.2g L-1 鼠尾胶，37℃，50mL L-1 CO2 孵箱培养.细胞接种于24孔培养板，在细胞对数生长期加入药物处理.实验分组为:①空白对照组，不加GM1与L-dopa;②L-dopa作用组，加入200μmol L-1 L-dopa;③GM1作用组，加入GM1与L-dopa，GM1终浓度分别为10，50和100μmol L-1 ，L-dopa为200μmol L-1 . 1.2.2 台盼蓝染色评估细胞活性 将5g L-1 的台盼蓝5μL分别加入上述各组处理24h后的细胞悬液40μL中.受损伤或死亡的细胞胞膜破裂，染料进入细胞内与DNA结合，使其染成蓝色.而活细胞因胞膜完整而拒染，通过血细胞计数器随即取3个视野计数，计算平均值. 1.2.3 形态学观察细胞 将部分PC12细胞移植培养皿中，进行细胞爬片.待细胞生长良好时加入L-dopa和GM1处理，培养12h及24h，HE染色，光镜下观察. 1.2.4 流式细胞仪检测 分别取上述分组中处理24h的细胞液经2.5g L-1 胰酶和0.2g L-1 EDTA液消化，制成细胞悬液，调整细胞数至1×109 L-1 ，离心后弃去上清，悬浮于2mL，4℃预冷的PBS中，按每1mL悬液加入2mL4℃冷乙醇的量固定24h，按1 1加入碘化丙啶（PI）染色，4℃放置20～30min，流式细胞仪中进行分析. 1.2.5 透射电镜检查 分别取上述各浓度组12h及24h的细胞悬液离心后弃去上清.加入4℃预冷的2g L-1 戊二醛4mL，4℃固定30min，送电镜室脱水包埋制成超薄切片，透射电镜下观察照相. 1.2.6 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 分别取上述各组24h的细胞液，调整细胞数至5×109 L-1 ，裂解液裂解，RNAase、蛋白酶K孵育，酚抽提，乙醇沉淀，每样品提取DNA10μg经10g L-1 琼脂糖凝胶在6V cm-1 电压下进行电泳分析.