神经营养素┐3重组腺病毒促进脊髓背根神经节的存活论文.docVIP

　　神经营养素┐3重组腺病毒促进脊髓背根神经节的存活论文 .freelultiplicity of infection，MOI）的Ad-NT-3，观察DRG细胞的形态，MTT法测定DRG细胞的增殖活性. 结果 当加入MOI为10和50的Ad-NT-3时，形态学观察发现，DRG细胞数目增加，突起变长，尤其以3d后表现更为明显;DRG细胞的增殖活性显著增加（P 0.01）.当MOI为100时1d和3d，DRG细胞数目明显减少，无突起或变短，部分细胞死亡;MTT法测定DRG细胞的增殖活性均显著降低（P 0.01）. 结论 NT-3基因能通过腺病毒介导表达NT-3蛋白，促进体外培养DRG细胞的存活. Keyoting sur-vival of adenovirus vector for neurotrophin3（NT-3）（Ad-NT-3）on dorsal root ganglia（DRG）.METHODS Primary culture of DRG cells ental groups Ad-NT-3ultiplicity of infec-tion（MOI）respectively.Groups added edium served as control.The morphology and MTT test of the DRG cells ount and MTT test of DRG cells increased significantly and the neurite became longer.OI ount and MTT test of DRG cells decreased significantly and the neurite became shorter.The DRG cells greally in control groups.CONCLUSION Ad-NT-3can promote survival of the DRG neuron in vitro. 0 引言 周围神经损伤后相应中枢神经元会发生退变坏死，失神经支配的靶器官也会感觉缺失、肌肉萎缩.即神经损伤是损伤局部、神经元、靶器官三个水平的病变［1］ .而中枢神经元的存活是周围神经再生的基础和先决条件.研究证明，新生大鼠轴突切断引起大量运动神经元死亡，使用睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，TF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）或胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neu-rotrophic factor，GDNF）能阻止该过程［2，3］ .本实验采用原代培养大鼠的DRG细胞，然后加入不同MOI的Ad-NT-3，观察DRG细胞的形态，MTT法测定DRG细胞的增殖活性，以明确Ad-NT-3对体外培养DRG细胞存活的促进作用. 1 材料和方法 1.1 材料 Ad-NT-3和复制缺陷性重组腺病毒载体包装细胞系293细胞（人胚肾细胞系）由西安国际分子医学研究中心惠赠;D/F12干粉培养基、N1、胰蛋白酶购自Sigma公司;DMEM、胰蛋白酶抑制剂、胎牛血清购自Gibco公司;新生牛血清购自Hyclone公司;培养板购自Nunc公司;SD乳鼠购自本校实验动物中心. 1.2 Ad┐NT┐3的扩增、滴度测定 参照Manual of Quantum’s Unique Expression System Technology.293细胞用含10mL L-1 新生牛血清的DMEM，37℃，50mL L-1 CO2 ，饱和湿度培养.待细胞达到90%汇合时，加入Ad-NT-3重组腺病毒粗提液，更换为5mL L-1 DMEM培养液，继续培养3～5d，收集病变（cytopathic effect，CPE）的293细胞，重悬于5mL L-1 DMEM中，-80℃（至少2h），37℃反复冻融3次，离心弃沉淀，收集病毒上清分装后于-80℃保存备用.重组腺病毒滴度测定采用组织培养半数感染量法（tissue culture infectious dose50，TCID 50 ）. 1.3 新生鼠DRG细胞原代培养 将3～5d SD乳鼠5只断颈处死，无菌条件下快速取出双侧DRG，置于D1 -SGH（4℃）（D1 为无钙镁离子的Puck液，SGH为蔗糖、葡萄糖和HEPES缓冲液）溶液中，解剖显微镜下尽可能剥净外膜，剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm小块后移入1.25g L-1 胰蛋白酶于37℃，50mL L-1 CO2 孵箱消化30min，将消化后的组织吸入10mL离心管