端粒酶逆转录酶启动子hTERT-U6嵌合启动子的siRNA 表达载体的肿瘤靶向性分析论文.docVIP

　　端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA 表达载体的肿瘤靶向性分析论文 姜习新，张鹏辉，涂植光，杨毅，刘靳波 【摘要】 目的：体外研究siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性. 方法：常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌SMMC7721细胞株（EGFP7721）和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF（EGFPHELF）. 以PTZU6+1质粒转染EGFP7721细胞和EGFPHELF细胞为空白质粒组，siRNAEGFPPTZU6+1质粒转染EGFP7721细胞和EGFPHELF细胞为实验对照组，将siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1质粒转染EGFP7721细胞和EGFPHELF细胞作为实验组，用realtime SYBR Green PCR和ETHODS：Hepatocellular carcinoma cell SMMC7721 and human normal fibrocytes HELF, both expressing fluorescence protein (EGFP7721, EGFPHELF) stably id PTZU6+1, siRNAEGFPPTZU6+1 and siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1 ployed respectively as the empty vector groups, experimental control groups and experimental groups. Realtime SYBR green PCR and MC7721和hTERT阴性的人正常成纤维细胞株HELF，以探讨siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1质粒在肿瘤细胞中靶向性和有效性. 1 材料和方法 1.1 材料 GFP抗体购自中山公司，SYBR○REXSCRIPTTMRTPCR和PrimeScriptTM RT reagent Kit，rTaq酶、RNA提取试剂盒和PMD18T载体均购自TaKaRa 公司. 针对绿色荧光蛋白基因(EGFP)的含hTERT/U6嵌合启动子的siRNA 表达载体(siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1)和针对绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA表达载体(siRNAEGFPPTZU6+1)为本课题组以前构建, 其中siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1重组质粒根据hTERT核心启动子插入U6启动子方向不同，有正向和反向重组质粒之分. 引物由上海生物有限公司合成. Lightgen HRP kit购自维奥基因发展有限公司. 稳定表达EGFP的肝癌细胞株SMMC7721为本课题组以前构建. 人正常成纤维细胞株HELF购自南京凯基生物有限公司. Lipofectamine质粒转染试剂购自Invitroge公司. 人正常成纤维细胞株HELF购自南京凯基生物技术有限公司. 化学发光成像仪ABI7000（维奥基因发展有限公司，宁波）. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 稳定表达EGFP的7721细胞和人正常成纤维细胞HELF培养于含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养基内，在50 mL/L CO2，37℃条件下，培养2～3 d后，用2.5 g/L胰酶消化，传代1次. 1.2.2 构建稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF 6孔板上的HELF长满到7/10时，240 μL血清DMEM中加入4 μg EGFP质粒. 将250 μL的DNA脂质体混合物加入用无血清DMEM清洗3遍的6孔板中，加无DMEM至2 mL. 50 mL/L CO2，37℃培养4～5 h后，换成有血清的DMEM继续培养. 筛选 24 h 后观察荧光，G418（800 mg/L）筛选15 d. 单克隆细胞株的构建:将筛选后转染EGFP的HELF细胞用胰酶消化后离心、计数，稀释成5000个/L，96孔板每孔加入200 μL, 50 mL/L CO2，37℃ 条件下培养. 1.2.3 转染 将稳定表达EGFP的单克隆细胞株SMMC7721和HELF传至6孔板，按1×108个/L的密度分别传3孔. 将PTZU6+1质粒分别转染稳定表达EGFP的7721和HELF为空白质粒组,.freelin，85℃ 5 s. 1.2.5 标准品的制备 将cDNA经PCR扩增，PCR产物胶回收后与PMD18 T载体相连（步骤见说明书），挑取出阳性克隆测序. 用紫外分光光度仪测量提取的质粒(要求A260nm/A280nm为1.7～2.0，并估算DNA的含量)，浓度为0.236 g/ L. 1.2.6