组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A联合全反式维甲酸诱导PLZFRARα阳性U937细胞分化论文.docVIP

　　组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A联合全反式维甲酸诱导PLZFRARα阳性U937细胞分化论文 陈思宇 马立恒 董颖 贾培敏 陈丽娟 郑磊贞 王振义 【摘要】 目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)和全反式维甲酸(ATRA)对PLZFRARα阳性细胞的作用. 方法：稳定转染PLZFRARα基因的U937细胞(U937/PLZF)经TSA, ATRA作用一段时间后，TT法检测细胞生长和增殖状态，流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面分化抗原CD11b，CD64，CD14等的表达，荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达，细胞化学染色和硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况. 结果：U937/PLZF细胞在去除四环素条件培养后.freelol/L)使U937/PLZF细胞核质比缩小，生长增殖受抑，S期细胞减少，CD11b表达增高，PLZFRARα蛋白表达减弱，分布以胞核弥漫细小颗粒为主，细胞功能上的分化可能尚不成熟. 结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使U937/PLZF细胞发生部分分化. 【关键词】 PLZF；维甲酸；组蛋白去乙酰化酶；分化；白血病,早幼粒,急性 【Abstract】 AIM: To investigate effects of alltrans retinoic acid (ATRA) and trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor, on PLZFRARαpositive cells. METHODS: PLZFRARαpositive U937 cells (U937/PLZF) odel. The change of cell morphology sa staining, cell groethyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, cell cycle distribution and expression of cell membrane surface differentiationrelated antigens (such as CD11b, CD64 and CD14) ined by floetry assay. Expression of PLZF munofluorescence. Functional differentiation (NBT) reduction ability and cytochemical staining. RESULTS: TT法检测细胞生长按照文献［2］方法操作，570 nm处测A值. 细胞生长抑制率=（1-处理组平均A值/对照组平均A值）×100%. 重复3次取平均值. 1.2.2流式细胞仪检测细胞周期及凋亡取约1×106细胞，冷乙醇固定，Rnase (终浓度200 mg/L)消化，20 mg/L碘化丙啶(PI)染色30 min，用流式细胞仪(BeckmonCoulter)检测细胞不同DNA含量分布，经Multicycle软件分析细胞周期和凋亡细胞. 1.2.3检测细胞表面分化抗原取细胞悬液100 μL（约含5×105细胞），加入FITC或PE标记的鼠抗人CD11b，CD64，CD14 mAb和相应的同型抗体（同种荧光标记的非特异性鼠抗人IgG1，IgG2α）（均购自CoulterImmunotech, France），室温下避光孵育30 min，PBS清洗，重悬细胞，立即进行流式细胞仪检测. 1.2.4检测融合蛋白表达细胞涂片，-20℃预冷甲醇/丙酮(1∶1)固定液浸泡固定5~10 min, PBS浸洗，30 g/L BSA封闭，一抗(goat antiPLZF, Santa Cruz)室温孵育1 h，PBS洗5 min×5次，二抗(FITCrabbit antigoat IgG) 室温孵育1 h，PBS洗5 min×5次，PI复染，封片，激光共聚焦显微镜下观察. 1.2.5细胞化学染色氯乙酸ASD萘酚酯酶染色(CE), 醋酸ASD萘酚酯酶染色(AE), 过碘酸席夫试验（糖原染色，PAS）, 过氧化物酶染色(POX)，按照常用方法进行. 1.2.6硝基蓝四氮唑还原试验取约1×106细胞，PBS清洗后加入硝基蓝四氮唑(NBT)反应液，37℃孵育30 min，混悬细胞，离心(500 r/min×5 min)涂片，光镜下计数阳性细胞率，每个视野至少计数200个细胞. 2结果 U937/PLZF细胞在添加0.5 mg/L嘌呤霉素(puromycin), 0.1 mg/L四环素(tetracycline)和1 g/L G418培养液中维持培养，PLZF