细胞因子受体嵌合抗体真核表达载体的构建论文.docVIP

　　细胞因子受体嵌合抗体真核表达载体的构建论文 吴静 张平 周昌华 赵宗容 魏大鹏 章崇杰 【摘要】 目的：构建细胞因子受体抗人AFP嵌合抗体基因真核表达载体。方法：用RTPCR方法从人胚肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因，并用限制性酶切连接方法拼接。用PCR方法从抗人AFP单链抗体表达载体中扩增VL、VH基因，分别与人kappa轻链和人gammal重链恒定区基因重组，获得人鼠嵌合轻链和重链，再将EpoRgp130与嵌合重链连接，最后将嵌合轻链和HEpoRgp130分别连接到质粒pVITRO上，构建pVITROEgIg载体。结果：获得EpoR胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp。重组真核表达载体经限制性酶切鉴定示EpoR、gp130基因、嵌合重链基因和嵌合轻链基因正确连接到载体pVITRO。结论：成功构建细胞因子受体抗人AFP嵌合抗体基因表达载体。 【关键词】 EpoR；gp130；嵌合抗体；克隆 单克隆抗体技术自1975年问世以来.freelediated geically modified cell amplification,AMEGA），将抗体的VL、VH与EpoR D2功能区和gp130跨膜功能区嵌合表达于细胞膜上，在细胞培养基中加入抗原，通过抗原与抗体的结合，有效地激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而大量扩增细胞3。本研究借鉴这一细胞扩增体系构建细胞因子受体抗人AFP人鼠嵌合抗体基因，探索获得高表达全抗体的新方法。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株、质粒大肠杆菌菌株E. coli DH5α由本室保存。pGEMTeasy载体购自美国Promega公司。载体pAG4622、pAH4604均由海军总医院王琰教授惠赠。质粒pVITRO2购自美国InvivoGen公司。抗人AFP单链抗体表达载体pET32/ScFv由本室构建。 1.1.2实验标本标本来源于人胚胎肝脏组织，均取自非疾病死亡的引产胎儿，胎龄28周，胚胎的使用已得到医院和产妇的同意。 1.1.3主要试剂TRIZOL Reagent购自美国GIBCO BRL公司。One Step RNA PCR Kit（AMV）、Ex Taq、T4 DNA ligase及各种限制酶均购自大连TaKaRa公司。胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自美国Omega公司。寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。表1 PCR引物的名称和序列 1. 2方法 1. 2. 1 EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆和拼接Trizol法提取4月孕流产胎儿肝脏总RNA，用EPF1/EPR1引物对扩增EpoR胞外区基因，用GPF/GPR引物对扩增gp130跨膜区基因，RTPCR反应条件为50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。胶回收纯化RTPCR反应产物EpoR1和gp130，并分别克隆到pGEMT easy载体上，测序鉴定。用EPF2/EPR2引物对从EpoR1T载体上扩增EpoR胞外区基因，在其5′加入肠激酶（enterokinase）的碱基序列：GACGACGACGACAAG，胶回收纯化PCR反应产物EpoR2，并克隆到pGEMT easy载体上，测序鉴定。用HindⅢ和ClaⅠ双酶切gp130T载体中的gp130跨膜区基因，和相应酶切的EpoR2T载体连接，获得eEpoRgp130T载体。 1. 2. 2人鼠嵌合抗体轻链载体的构建用VLF/VLR引物对从抗AFP单链抗体表达载体pET32/ScFv中扩增VL基因，用CLF/CLR引物对从含有人kappa轻链恒定区序列的载体pAG4622中扩增CL基因4，分别克隆到pGEMT easy载体上，测序鉴定。用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切VLT载体中的VL基因，和相应酶切的载体pVITRO连接，获得pVITROVL载体。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切CLT载体中的CL基因和相应酶切的载体pVITRO连接，获得pVITROL载体。 1. 2. 3人鼠嵌合抗体重链载体的构建用VHF1/VHR引物对从抗AFP单链抗体表达载体pET32/ScFv中扩增VH1基因，克隆到pGEMT easy载体上，测序鉴定。用EcoR V和NheⅠ双酶切VH1T载体中的VH基因，和相应酶切的含有人gamma1重链恒定区序列的载体pAH4604连接4，获得VHpAH4604载体。用VHF2/CHR引物对从VHpAH4604载体中扩增人鼠嵌合重链基因VHCH，克隆到pGEMTeasy载体上，测序鉴定。 1. 2. 4细胞因