结核杆菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究论文.docVIP

　　结核杆菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究论文 .freelphocytes and immune mechanisms in mice immunized by Mycobacterium tuberculosis H37Ra Abstract AIM: To explore the specific cytotoxicity of spleen lymphocytes and the immune mechanisms in mice immunized by Mycobacterium tuberculosis（MTB）H37Ra. METHODS: At the various interval (30days, 60days) after the mice munized by MTB H37Ra, BCG and PBS, the spleen lymphocytes of the immunized mice phocytes in the immunized mice easured by MTT assay. Spleen lymphocytes munization and stimulated e B on mRNA level phocytes in the group immunized by MTB H37Ra RNA expression of perforin, granzyme B in H37Ra group and BCG group RNA in H37Ra group e B mRNA betphocytes is enhanced after mice munized by MTB H37Ra, ay be related to the expression of perforin and granzyme B. Keyphocyte; perforin; granzyme B 摘 要 目的: 探讨结核杆菌H37Ra免疫小鼠后, 产生特异性的脾淋巴细胞杀伤活性及其免疫机制。方法: (1)分别以结核杆菌H37Ra、 BCG和PBS免疫小鼠后第30天及第60天, 分离各组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞, 以表达Ag85B分泌蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞, 用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的杀伤率; (2)在免疫后第60天, 小鼠脾淋巴细胞经PPD刺激后, 以RTPCR法检测穿孔素mRNA及颗粒酶B mRNA的表达。结果: (1)结核杆菌H37Ra组脾淋巴细胞的杀伤率明显高于PBS对照组(P 0.05), 略高于BCG组; (2)H37Ra组和BCG组穿孔素、 颗粒酶mRNA的表达量均显著高于PBS组（P 0.05）, H37Ra组穿孔素mRNA的表达量显著高于BCG组(P 0.05), 但颗粒酶B mRNA的表达量两组无差异。结论: 结核杆菌H37Ra免疫小鼠后, 能增强脾淋巴细胞的杀伤活性, 其机制可能与增加穿孔素、 颗粒酶B的表达有关。 关键词结核杆菌H37Ra; Ag85B蛋白; 小鼠淋巴细胞; 穿孔素; 颗粒酶B 近年来, 由于人口流动的增加, 多重耐药菌株的流行, 以及结核分枝杆菌（MTB）和HIV的双重感染, 导致TB的发病率和死亡率大副度提高。而目前惟一获准使用的卡介苗（BCG）的预防效果又不甚理想, 对不同的人群保护力差异较大, 因此, 世界各国加强了对宿主抵抗结核杆菌免疫机制的研究。H37Ra是由H37Rv（人型结核分枝杆菌标准毒株）多次传代后获得的无毒株。国内外文献报道, H37Ra具有毒力较低、 抗原性完整1, 2及能充分活化巨噬细胞3, 4等优点, 因此, 结核杆菌H37Ra作为侯选减毒活疫苗具有相对的优势。然而如何提高CD8+ T细胞的特异性杀伤活性, 是研制新型抗结核疫苗迫切需要考虑的问题。以往结核疫苗的研究中, 有关特异性小鼠脾淋巴细胞杀伤作用的研究较比浮浅。Ag85B是结核分枝杆菌的主要分泌蛋白, 可诱发对MTB的保护性免疫应答。本研究中拟用能表达此目的蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞, 检测结核杆菌H37Ra免疫小鼠后, 诱导机体产生特异性脾淋巴细胞杀伤活性的效果, 并从分子水平上检测穿孔素、 颗粒酶mRNA的表达, 以探讨小鼠脾淋巴细胞抗MTB感染的免疫机制。 1 材料和方法 1.1 材料 携带有Ag85B分泌蛋白基因的真核表达质粒pTB30m, 由华中科技大学同济医学院微生物教研室范雄林博士馈赠, 本室保存。结核杆菌H37Ra、 BCG菌株由本室保存。Sp2/0细胞由重庆医科大学感染病研究所提供。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。总RNA提取试剂Trizol购自上海生工公司。RT