缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响论文.docVIP

　　缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响论文 刘晓娟 惠延年 郭斌 张乐 郝晓凤 【摘要】 目的：观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外大鼠Müller细胞的影响。方法：体外酶消化法纯化培养并鉴定大鼠Müller细胞。台盼兰染色测定细胞活性。应用光镜、细胞计数、免疫细胞化学、MTT法、原位细胞凋亡等方法分析Müller细胞在不同的缺氧时间（0~24 h）、添加不同浓度VEGF（10～100 μg/L）及VEGF受体Flk-1阻断剂SU1498处理后，细胞中VEGF和Flk-1，Flt-1的表达、细胞活性及凋亡等变化。 结果：纯化培养至第3代的Müller细胞，经鉴定其纯度为90%，活力是87.3%。缺氧8～12h时Müller细胞胶质源纤维酸性蛋白（GFAP）染色增强，VEGF和Flk-1，Flt-1表达增加，可见细胞肿胀、脱落。缺氧20h时.freelary cultured rat Müller cells under hypoxia in vitro. METHODS: The rat Müller cells orphology and glial fibrillary acidic protein (GFAP). The cell viability icroscopy, MTT assay, TUNEL labeling and SABC immuno-histochemistry easure the changes of cell morphology, gro mixed cells (purity 90%, viability 87.3% in Passage 3) and passaged serially. After hypoxia for 8-12 hours, the proliferation and viability of the cells increased progressively, and the expression of GFAP, VEGF, Flk-1 and Flt-1 also increased. But the increased cells shoedium. After hypoxia for 20 hours,.freeledium reached 75μg/L, the cell viability increased 1.3 fold and the apoptosis index reduces to tal conditions, Flk-1 and Flt-1 expressed at a loay exert neuroprotective effects partially on the Müller cells via VEGF receptor-Flk-1 and Flt-1 in vitro. · KEYüller细胞的影响。我们研究缺氧条件和外源性VEGF处理后，Müller细胞中VEGF及Flt-1，Flk-1的表达，以期初步揭示缺氧条件下VEGF对Müller细胞的影响。 1材料和方法 1.1材料 健康封闭群二级SD新生大鼠10只，由第四军医大学实验动物中心提供。培养Müller细胞的培养基DMEM和MTT试剂分别购自Gibco和Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司，GFAP抗体、VEGF受体Flk-1、Flt-1的抗体和VEGF抗体购自博士德公司；VEGF购自北京中杉公司；SABC试剂盒购自博士德公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司，其它化学试剂均为国产分析纯试剂。 依据改良的视网膜Müller细胞制备方法7-10。眼球取自出生1in，过双层的53μm尼龙筛网，400g离心10min，用含有100mL/L胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM中和，400g离心10min。加入100mL/L FBS的DMEM 1.5mL吹打细胞，悬浮接种于培养皿中，加入含有200mL/L FBS的DMEM培养液，培养于37℃，50mL/L CO2，950mL/L 空气，3d换液，待细胞融合，加入含1g/L胰蛋白酶，待细胞收缩，部分细胞悬浮后，将其吸出弃掉，加入含200mL/L FBS的DMEM培养液继续培养。如此2～3遍，细胞形态基本一致后，按1∶2比例进行传代，传3～4代后行免疫组织化学技术鉴定细胞：一抗为兔抗大鼠胶质源纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP），二抗是FITC标记的抗兔IgG抗体，荧光显微镜观察。细胞纯度分析：计算单位视野内GFAP表达阳性的细胞占总细胞的比例。细胞活力分析：台盼兰染色，活细