缺氧海马神经元中KATP对基因Bax表达的影响论文.docVIP

　　缺氧海马神经元中KATP对基因Bax表达的影响论文 【摘要】 目的 研究缺氧海马神经元中KATP对基因Bax表达的影响。方法 对原代海马神经元进行缺氧和药物处理，倒置显微镜和NF免疫组织化学法观察细胞生长和形态，MTT法检测细胞凋亡率，RTPCR检测Bax基因mRNA表达水平。结果 与单纯缺氧组比较，缺氧+二氮嗪组和缺氧+甲苯磺丁脲组的多级神经元百分率和细胞存活率差异有显著性(P 0.01)。缺氧+二氮嗪组中基因Bax的mRNA表达水平与单纯缺氧组相比下降(P 0.01)，缺氧+甲苯磺丁脲组中基因Bax的mRNA表达水平相对于单纯缺氧组也有提高(P 0.05)。结论 缺氧时KATP的开放对细胞具有保护作用，它通过降低Bax的表达抑制缺氧海马神经元的凋亡。 【关键词】 KATP;Bax基因;缺氧; 海马神经元 Abstract:Objective To study the effect of KATP on gene Bax in hippocampal neurons under hypoxia condition.Method The neurons edicine. Inverted microscope and immunohistochemistry of NF ed to assess the groorphology of the cells. Cell viability easured RNA levels.Results pared ultipolar neuron and survival rate of primary cultured hippocampal neurons in diazoxide and tolbutamide ents shoRNA levels (P 0.01) in neurons cultured at severe hypoxia condition pared oxia. In hypoxia groups,tolbutamide increased Bax mRNA expression (P 0.05),pal neurons from hypoxia by suppressing Bax expression. Key pal neuron ATP敏感性钾通道广泛分布于中枢神经系统和其他外周组织中，调控多种生理活动。缺氧作为一种重要的生理应激反应.freelg/L(Sigma公司,USA);血清(杭州四季青公司);甲苯磺丁脲(Sigma公司，USA);二氮嗪(Sigma公司，USA);二步法免疫组化检测试剂盒(DAKO);Trizol(Invitrogen，USA);一步法RNA PCR试剂盒(Takara，Japan)。 1.2 细胞培养 取出生后1 d的SD乳鼠，用体积分数75%的乙醇消毒，断头置于DHanks平衡盐溶液中。无菌条件下解剖出大鼠的大脑组织并置于另一含有Dhanks的器皿内。轻轻剔除脑膜及血管组织，进一步分离出双侧海马组织。移至含有Dhanks的小青瓶内，剪成约1 mm×1 mm×1 mm 小块(以上步骤均在冰上操作) 。加入5倍体积的1. 25 g/ L 胰酶(四季清)(37 ℃) ，消化10 min ，中间轻轻振摇2～3次，用含体积分数20%FBS的DMEM终止消化，400目筛网过滤，除去未消化完全的组织块。将过滤得到的细胞悬液移入离心管中，1 000 r/min离心5 min。此时大部分的神经细胞已经沉淀到离心管底部，去除上层培养液，加入新培养液，用吸管轻轻吹打，重新悬浮细胞。将细胞浓度调至1×106个/mL左右，接种于包被有多聚赖氨酸(10 mg/mL，Sigma)的培养板中，置于φ=5%的CO2培养箱中培养(37 ℃)，48 h后使用阿糖胞甘(AraC)处理细胞48 h，以去除其中的增殖细胞，以后每3天换液1次，每次换半量。使用的是含有体积分数10%胎牛血清(四季清)、青霉素1 U/L单位和链霉素100 mg/L单位(Gibco)的DMEMF12培养基(四季清)进行培养。 1.3 缺氧处理和分组 实验分为6组。①常氧组：细胞于37 ℃孵育,并持续通以950 mL/L O250 mL/L CO2 混合气。②常氧+二氮嗪组：细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/L二氮嗪的培养基，细胞于37 ℃孵育，并持续通以950 mL/L O250 mL/L CO2 混合气。③常氧+甲苯磺丁脲组，细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/L甲苯磺丁脲的培养基，细胞于37 ℃孵育，并持续通以950 mL/L O250 mL/L CO2 混合气。④缺氧组：细胞于37 ℃孵育，并通入950 mL/L N250