营销研究绿盲蝽AlEcR_A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答_谭永安.pdf

中国农业科学 2017,50(1):86-93 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.008 绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及 在外源20E诱导下的应答 1 1 2 1 1 1 谭永安 ，肖留斌 ，郝德君 ，赵静 ，孙洋 ，柏立新 1 2 （江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014 ； 南京林业大学林学院，南京 210037 ） 摘要：【目的】获得绿盲蝽（ Apolygus lucorum ）蜕皮激素受体（AlEcR-A ）原核表达的重组蛋白，制备单克 隆抗体，分析绿盲蝽 AlEcR-A 在外源蜕皮激素(20E)诱导下 mRNA 及蛋白表达量的变化趋势，为进一步研究 EcR 的 功能奠定前期基础，同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A 的 基础上，将含有其基因的T 载体经 Nde I和 XbaI双酶切，构建AlEcR-A原核表达载体（pCzn1-AlEcR-A），将该表 达载体经 IPTG 诱导表达和蛋白 Ni-IDA 亲和纯化，以获得 AlEcR-A 基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫 反应，取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体， 通过抗体纯化，Western blot 检测该抗体能否特异性结合 AlEcR-A 重组蛋白及绿盲蝽总蛋白，从而制备得到 AlEcR-A 蛋白单克隆抗体。最后利用 RT-PCR 及 Western blot 方法，进行 20E 微注射绿盲蝽 2 龄若虫，分析 8 d 内AlEcR-A 的 mRNA 及蛋白含量的变化，明晰 20E 诱导下 AlEcR-A 的应答反应。【结果】 经Nde I 和 XbaI 双酶切 后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌 Arctic express中能高效表达一个约为55 kD 的蛋白，且该重组蛋白 经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在；经Ni-IDA亲和层析后，pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD 附近有一条明显的特异性条带，说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备，获得了 1 株能稳定分泌抗 AlEcR-A 蛋白单克隆抗体的细胞株，命名为 8H7；Western blot 分析表明，该细胞株不仅能与绿 盲蝽总蛋白结合，还可特异性与AlEcR-A 重组蛋白反应，且条带大小一致，说明制备的AlEcR-A 单克隆抗体准确、 有效；RT-PCR 及 Western blot 结果表明，与注射蒸馏水相比，20E 微注射处理后的绿盲蝽 AlEcR-A mRNA 表达量 及蛋白表达量均显著升高，且随着处理时间的延长，其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的能稳 定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株，20E有诱导 AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用。 关键词：绿盲蝽；蜕皮激素受体；20-羟基蜕皮酮；单克隆抗体；表达量 Preparation of Monoclonal Antibody Against AlEcR-A Protein and Its Response Induced by Exogenous 20-Hydroxyecdysone in Apolygus lucorum 1 1 2