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临床科研设计和SCI论文策略 ---RNA干扰技术的应用 湖南省生物医学信息专业委员会 长沙赢润生物技术有限公司 讲座提纲 一. 科研选题及设计：以SCI为目标 二. 临床样本在基因功能研究中的作用 三. RNA干扰技术在基因功能研究中的应用 四. RNA干扰技术在发表SCI论文中的应用 一. 科研选题及设计：以SCI为目标 SCI没有捷径，但是有小技巧和经验。 阅读文献是基础，必不可少。 他山之石，可以攻玉。 参考前人的经验，获得自己的Idea。 如何选题 部位 前人的经验： 发现某基因在肝癌组织中表达增高，并有很多机制。 我们的借鉴： 拜读大作后，茅塞顿开。查文献后，确定在乳腺癌中尚无人涉 及，于是，SCI处女作出炉：某基因在乳腺癌组织中表达增高。 注：全身器官那么多，你只要看文献比较及时，比较多，不太 晚，总能找到合适的方向。 药物 前人的经验： 发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种临床疾病， 且对其原理进行了研究，找到了相关基因。  我们的借鉴： 拜读大作后，联想到了阿托伐他汀，于是SCI处女作 出炉：阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。  注：同一类的药物有那么多种，您完全可以换一种药 物拿来做一下试试。 机制 前人的经验： 发现某基因具有抗氧化应激的作用。  我们的借鉴： 拜读大作后，联想到氧化应激在好多疾病的病理机制 中都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等 等，于是SCI处女作出炉：某基因在糖尿病肾病中的 作用。  注：注意串联联想： 基因 机制 临床疾病 基因 上下游基因 前人的经验： 发现A基因具有某种作用。  我们的借鉴： 拜读大作后，联想到A基因的上游或下游基因是B基 因，是否也有这种作用？于是SCI处女作出炉：B基 因具有某种作用。 注： 需要一定的知识基础，但相对于机制来说简单一点。 家族基因或者相同作用的基因 前人的经验： 发现某种药物能够对TNF-α产生影响。  我们的借鉴： 拜读大作后，联想到IL-6以及CRP都是炎症因子，有 可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响，于是SCI处女 作出炉：某种药物对IL-6以及CRP的影响。 注：有相同作用的基因有很多，注意联想。 如何设计自己的课题 不要把实验设计得过广。 只要在一点上面做得稍微有深度就行了。 不要用一个实验来证明N个结论，而是要用N个实验来证明一个结论---即使这几个实验都比较简单。 做出深度，做出层次来。 二. 临床样本在基因功能研究中的作用 确定目的基因和临床疾病之间的关系 确定目的microRNA和临床疾病之间的关系 通常是整个课题的起始 二. 临床样本在基因功能研究中的作用 确定预研究的目的基因后，如何设计课题？ 基因功能研究的两方面： A. 基因的过表达---基因表达上调； B. 基因的RNA干扰---基因表达下调。 两者相辅相成，互为佐证。 紧贴临床疾病的基因治疗这一目的。 三. RNA干扰技术在基因功能研究中的应用 3.1 靶位点的选择 shRNA序列设计 3.2 shRNA表达载体构建 3.3 筛靶：确定最有效的shRNA 3.4 转染或感染目的细胞，表达shRNA 3.5 检测或验证RNA干扰效果 3.6 RNA干扰回复实验 3.7 动物模型实验 RNA干扰实验流程图 3.1 靶位点的选择 shRNA序列设计 非常重要的一步！事半功倍 or 事倍功半？ 现有免费软件设计：成功率较低（30%左右） 商业化软件或shRNA库：成功率高（75%以上） Yrbio shRNA库 让您的RNAi实验有一个良好的起点！ 真正做到事半功倍！ 包含TRC、Ambion等多个组织或机构开发的shRNA库； 针对人及小鼠数万个基因，每个基因提供3~5条shRNA； 库中shRNA有效率高达75%！大部分shRNA干扰效率超过80%！ 3.2 shRNA表达载体构建 TRC原装进口shRNA表达系统 优点： （1）原装进口产品，本公司未做任何改动。 （2）既可当作普通shRNA真核表达载体使用，同时也是慢病 毒包装系统中的穿梭载体，可以用来包装慢病毒。 缺点： （1）载体上没有荧光标记。 （2）慢病毒的生物安全性，对实验室条件要求较高。 （3）载体拷贝数较低，测序比较困难。 3.2 shRNA表达载体构建 赢润shRNA表达系统 （1）shRNA序列数据依然来自TRC、Ambion shRNA数据库， 质量有保证，靶位点成功率高。 （2）您可以选择构建一条或者多条shRNA，灵活度高。 （3）多种启动子，有荧光或无荧光，绿色荧光或红色荧光等 可自由选择，能