转氨基作用纸层析法.docVIP

转 氨 基 作 用 原理 氨基酸分子上的氨基转移到α-酮酸分子上的反应过程称为转氨基作用（或称氨基移换作用）。转氨基作用是氨酸代谢的重要反应之一，由转氨酶催化。经转氨后，原来的α-—氨基酸变成了相应的α-—酮酸，原来的α-—酮酸则成为新的、相应的α-—氨基酸。 本实验观察谷氨酸与丙酮酸在肌匀浆中的谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称GPT）的催化进行转氨基的过程。然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。为便于观察转氨基作用，在反应中须加一碘醋酸（或—溴醋酸），以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代谢过程。 试剂 0.9% NaCl溶液；0.01mol/L磷酸缓冲液（PH7.4）；1%谷氨酸钾溶液；1%丙酮酸钠溶液；0.25%一碘酸钠溶液；2%HAc。 操作 1、肌匀浆的制备（该步由实验室准备室制备） 取小白兔一只，猛击头部处死后，立即剪颈放血，取肌肉若干经0.9%NaCl溶液洗去血污后，称取肌肉约100g置电动匀浆器中，再加0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液500ml磨成匀浆。 2、转氨基反应：取小试管2支编号，所加试剂以滴为单位。 ????????????? 编? 号 ? 试? 剂 ???????? 1 ????????? 2 肌匀浆 ???????? 10 ????????? 10 将2号管置沸水浴中5分钟，然后取出冷却 1%谷氨酸钾 ???????? 10 ????????? 10 1%丙酮酸钠 ???????? 10 ????????? 10 0.25%—碘醋酸钾 ????????? 5 ?????????? 5 混匀后同置37-40℃水浴中保温1小时（时加振摇）。取出两管各加入2%醋酸2滴，再同置沸水浴中5分钟，使反应停止，稍冷却，将上清液用于纸层析。 纸 层 析（氨基酸） 原理 层析法又称色层分离法，原指有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法。后来此方法也应用于无色物质的分离。层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析、分配层析和亲和层析等。纸层析是分配层析中的一种。 分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用a表示分配系数。 溶质在固定相中的浓度（Cs） a = ————————————— 溶质在流动相中的浓度（CL） 一种物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。 纸层析是以纸作为惰性支持物的分配层析，纸纤维上的羟基具有亲水性，因此以滤纸吸附的水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂沿着滤纸自下而上流动的，称为“上行法”；自上而下流动的，称为“下行法”。 将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展开，样品中的种种溶质（如各种氨基酸）即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同的溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离出来，形成距原点不等的层析点。 ??? 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示； ????????????? 原点到层析点中心的距离 ????? Rf = ———————————————— ???????????????? 原点到溶剂前沿的距离 只要条件（如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数。故可根据Rf值作定性分析。层析后，各种溶质在滤纸上的位置可用适当的化学或物理方法处理而使其显示出来。对于氨基酸常用茚三酮使之显色。 结果?：（讨论写在下面） 班级： 　 　 学号：　　　　　　 　　姓名：　　 　 　　　　　　　　　　授课老师：肖