实验一蛋白质含量测定讲解.PDFVIP

实验一 蛋白质含量测定 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原 理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前 常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂 法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法， 即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较 准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质， 因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法 都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的 灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的 时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成 硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和 的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH | +3HSO → 2CO +3SO +4HO+NH (1) 2 4 2 2 2 3 NH2 2NH +HSO → (NH)SO (2) 3 2 4 4 2 4 (NH)SO +2NaOH → 2HO+NaSO +2NH (3) 4 2 4 2 2 4 3 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO 作催化剂，KSO 以提高溶液的沸点。收集氨可 4 2 4 用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋 白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即 得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵敏度低， 费 时 将蛋白氮转化 非蛋白氮 用于标准蛋白 (Kjedahl法 适用于0.2~ 8-10 为氨，用酸吸 （可用三氯 质含量的准确 ) 1.0mg氮，误 小时 收后滴定 乙酸沉淀蛋 测定；干扰少； 差为 ±2％ 白质而分 费时太长 离） 双缩脲法 灵敏度低 中 速 多肽键＋碱性 硫酸铵； 用于快速测 （Biuret法）1～20mg 20~30 Cu2＋→紫色 Tris 缓冲 定，但不太灵 分钟 络合物 液；某些氨 敏；不同蛋白 基酸 质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 快速 蛋白质中的酪 各种嘌吟和 用于层析 50～100μg 5～10 氨酸和色氨酸 嘧啶； 柱流出液的检 分钟 残基在280nm 各种核苷酸 测；核酸的吸